[發明專利]重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原及其生產方法、乙肝疫苗及其生產方法

有效

• 申請號: 201310306827.0
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103333938A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 甘建輝;饒洪沖;朱征宇;梁全;關敏;肖堅
• 申請（專利權）人: 深圳康泰生物制品股份有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/02;C07K1/16;A61K39/29;A61P31/20;A61P1/16
• 代理公司: 深圳市盈方知識產權事務所(普通合伙) 44303
• 代理人: 楊賢

技術領域

本發明涉及生物制藥技術，尤其涉及一種重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原及其生產方法、乙肝疫苗及其生產方法。

背景技術

乙行肝炎病毒（HBV）是一種DNA病毒，HBV感染呈世界性流行，但不同地區HBV感染的流行強度差異很大。據世界衛生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發性肝細胞癌。

我國是乙型肝炎高流行區，每年平均報告發病人50多萬例。多年來乙肝發病數和發病率在我國法定報告傳染中，一直高居前列，給病人、家庭、社會造成沉重的經濟負擔，是我國現階段最突出的公共衛生問題之一。乙型肝炎難治易防，接種乙肝疫苗是預防乙肝最有效、最經濟的方法。

1989年，美國（默沙東）默克公司與中國政府達成了技術轉讓許可協議，向中國轉讓當時最為先進的基因工程乙肝疫苗生產技術。我司從美國默克公司引進的基因重組酵母乙肝疫苗工業化生產技術，自1994年投產以來，累計銷售2億多人份，使得超過2億的中國兒童得到了有效保護，安全性和有效性得到了極高的評價。

我國從美國默克公司引進的基因重組酵母乙肝疫苗工業化生產技術，其生產乙肝表面抗原蛋白（HBsAg）的工藝主要包括：酵母培養→細胞破碎液→微過濾→硅膠吸附粗提純→疏水吸附精提純。其中硅膠吸附粗提純的工藝方法是：硅膠懸浮攪拌→硅膠沉降清洗→離心收集沉淀→硼酸緩沖液洗脫抗原→離心收集上清，得到粗純樣品硅膠洗脫液（簡稱離心法）。在這一粗提純工藝中，須使用8～10臺大容量中速離心機，生產操作時間為4天，手工操作強度大，工藝不能完全在密閉系統中完成。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原的生產方法，該方法可大大降低產品污染幾率、減輕人工勞動強度、節省設備投資和維修成本、減少設備占用空間，縮短生產時間。

本發明進一步所要解決的技術問題是：提供一種重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原，抗原污染率低，且生產工藝簡單、生產時間短、占用生產設備少、生產成本低。

本發明進一步所要解決的技術問題是：提供一種乙肝疫苗，該乙肝疫苗污染率低，且生產工藝簡單、生產時間短、占用生產設備少、生產成本低。

本發明進一步所要解決的技術問題是：提供一種乙肝疫苗的生產方法，該方法可大大降低產品污染幾率、減輕人工勞動強度、節省設備投資和維修成本、減少設備占用空間，縮短生產時間。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原的生產方法，該方法包括有用重組釀酒酵母種子培養酵母菌的酵母培養步驟、從所述酵母菌中提取抗原的抗原提取步驟和對所述抗原進行純化的純化步驟，所述純化步驟包括有依次進行的粗純化步驟和精純化步驟，在所述抗原提取步驟之后和純化步驟之前，還包括有：

去曲通步驟，將所述抗原提取步驟提取到的抗原用XAD-4柱循環去除曲通，得到去曲通抗原樣液；

所述粗純化步驟包括：

裝柱步驟，將孔徑為1000A、顆粒大小為35μm～70μm的大孔硅膠裝入層析柱中形成大孔硅膠柱后，用pH值為7.6±0.2的磷酸緩沖液對所述大孔硅膠柱進行平衡處理；

上樣步驟，將所述去曲通抗原樣液用NaOH調pH值至7.6±0.2后，上樣到所述大孔硅膠柱，其中，所述大孔硅膠柱與去曲通抗原樣液上樣量的體積比為1:1～1:3，上樣溫度為2～8℃；

后處理步驟，用pH值為7.2±0.2的磷酸緩沖液對上樣步驟所得的大孔硅膠柱進行洗雜后，在45～49℃溫度下用pH值為8.7±0.2的硼酸緩沖液對洗雜后的大孔硅膠柱進行洗脫處理并收集洗脫液，對所述洗脫液進行超濾濃縮處理，得到澄清抗原。

優選地，所述洗脫處理包括：

將洗雜后的大孔硅膠柱的溫度從2～8℃上升到45～49℃，上升時間控制在1.5小時以內；

在45～49℃溫度下用pH值為8.7±0.2的硼酸緩沖液對洗雜后的大孔硅膠柱進行洗脫處理并收集洗脫液，洗脫處理時洗脫線速度不超過80厘米/小時，洗脫液的pH值控制在7～9；

將洗脫液降溫至2～8℃，再進行超濾濃縮處理。

優選地，所述抗原提取步驟之中還包括：

蛋白酶抑制步驟，在所述抗原提取步驟提取到的抗原中加入蛋白酶抑制劑。

優選地，所述精純化步驟具體包括：