[發明專利]重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原及其生產方法、乙肝疫苗及其生產方法

有效

• 申請號: 201310306827.0
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103333938A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 甘建輝;饒洪沖;朱征宇;梁全;關敏;肖堅
• 申請（專利權）人: 深圳康泰生物制品股份有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/02;C07K1/16;A61K39/29;A61P31/20;A61P1/16
• 代理公司: 深圳市盈方知識產權事務所(普通合伙) 44303
• 代理人: 楊賢

1.一種重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原的生產方法，該方法包括有用重組釀酒酵母種子培養酵母菌的酵母培養步驟、從所述酵母菌中提取抗原的抗原提取步驟和對所述抗原進行純化的純化步驟，所述純化步驟包括有依次進行的粗純化步驟和精純化步驟，其特征在于，在所述抗原提取步驟之后和純化步驟之前，還包括有：

去曲通步驟，將所述抗原提取步驟提取到的抗原用XAD-4柱循環去除曲通，得到去曲通抗原樣液；

所述粗純化步驟包括：

裝柱步驟，將孔徑為1000A、顆粒大小為35μm～70μm的大孔硅膠裝入層析柱中形成大孔硅膠柱后，用pH值為7.6±0.2的磷酸緩沖液對所述大孔硅膠柱進行平衡處理；

上樣步驟，將所述去曲通抗原樣液用NaOH調pH值至7.6±0.2后，上樣到所述大孔硅膠柱，其中，所述大孔硅膠柱與去曲通抗原樣液上樣量的體積比為1:1～1:3，上樣溫度為2～8℃；

后處理步驟，用pH值為7.2±0.2的磷酸緩沖液對上樣步驟所得的大孔硅膠柱進行洗雜后，在45～49℃溫度下用pH值為8.7±0.2的硼酸緩沖液對洗雜后的大孔硅膠柱進行洗脫處理并收集洗脫液，對所述洗脫液進行超濾濃縮處理，得到澄清抗原。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脫處理包括：

將洗雜后的大孔硅膠柱的溫度從2～8℃上升到45～49℃，上升時間控制在1.5小時以內；

在45～49℃溫度下用pH值為8.7±0.2的硼酸緩沖液對洗雜后的大孔硅膠柱進行洗脫處理并收集洗脫液，洗脫處理時洗脫線速度不超過80厘米/小時，洗脫液的pH值控制在7～9；

將洗脫液降溫至2～8℃，再進行超濾濃縮處理。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原提取步驟之中還包括：

蛋白酶抑制步驟，在所述抗原提取步驟提取到的抗原中加入蛋白酶抑制劑。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述精純化步驟具體包括：

將所述澄清抗原依次經過丁基瓊脂糖疏水層析，硫氰酸鹽轉型處理，并用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為20～81ug/ml，除菌過濾后，得到HBsAg原液。

5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酵母培養步驟包括：

將表達HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種依次經錐形瓶、種子罐、生產罐進行發酵培養，收獲酵母菌；

所述抗原提取步驟包括：經高壓勻漿器破碎酵母菌，濾膜過濾除去酵母菌碎片，得到抗原。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于：所述表達HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種為美國默克公司生產的以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種。

7.一種重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原，其特征在于：該乙肝表面抗原采用如權利要求1-6中任一項所述的方法生產制得。

8.一種乙肝疫苗，其特征在于：該乙肝疫苗的活性成分包括有如權利要求7所述的重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原。

9.一種乙肝疫苗的生產方法，其特征在于，該方法包括如權利要求1-6中任一項所述的重組釀酒酵母表達的乙肝表面抗原的生產方法。