[發明專利]一種底物專一性提高的膽鹽水解酶突變體

有效

• 申請號: 201610070608.0
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105524907B
• 公開（公告）日: 2018-12-04
• 發明（設計）人: 劉松;堵國成;陳堅;畢潔
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

本發明公開了一種底物專一性提高的膽鹽水解酶突變體，屬于酶工程領域。本發明通過定點突變的方式，將來源于唾液乳酸桿菌的膽鹽水解酶BSH1位于底物結合口袋中的氨基酸位點酪氨酸(Tyr24)、丙氨酸(Ala58)、苯丙氨酸(Phe65)分別突變成丙氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，改變酶分子與底物之間的疏水相互作用和結合方式，提高了膽鹽水解酶的底物專一性。改造后的酶蛋白，有利于減少結合膽鹽水解反應中膽酸的生成量，提高乳酸菌的膽鹽耐受性，有助于膽鹽水解酶在調節宿主膽汁組成及流量中的應用研究。

技術領域

本發明涉及一種底物專一性提高的膽鹽水解酶突變體，屬于酶工程領域。

背景技術

乳酸菌(LAB)作為益生菌，是一類在食品、農業、醫學等領域廣泛應用的工業菌株。為了有效發揮其益生功能，乳酸菌需要耐受來自宿主胃腸道環境的各種生理化學屏障，其中，腸道膽汁中的結合膽鹽是乳酸菌面臨的脅迫之一。目前已知廣泛存在與腸道微生物胞內的膽鹽水解酶(BSH)具有廣泛的底物特異性，幾乎能夠水解膽汁中所有的結合膽鹽生成游離膽酸和氨基酸，解除結合膽鹽的毒性，但是過多的膽酸又會造成新的脅迫，因此提高BSH的底物專一性，可以起到減少膽酸生成的目的。

同時，膽汁酸作為一種信號物質，在生物循環中，參與了機體脂質、膽固醇和糖的生化代謝及調節，因此，研究人員認為改變膽汁酸的組成和流量可以作為一種治療代謝綜合征的新方向。運用基因工程手段提高膽鹽水解酶的底物專一性不僅能夠提高乳酸菌的腸道定植能力，也為運用BSH調節宿主健康狀況提供技術平臺。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種底物專一性提高的膽鹽水解酶突變體，所述突變是對氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的來源于唾液乳酸桿菌的膽鹽水解酶BSH1內部氨基酸進行定點突變，從而提高了膽鹽水解酶的底物專一性。

所述突變是將膽鹽水解酶第24位的酪氨酸突變為丙氨酸，得到突變體Y24A；或將58位的丙氨酸突變為谷氨酰胺，得到突變體A58Q；或將65位的苯丙氨酸突變為丙氨酸，得到突變體F65A。

所述膽鹽水解酶突變體Y24A、A58Q、F65A的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7所示。

本發明的第二個目的是提供編碼所述膽鹽水解酶突變體的核苷酸片段、含有所述膽鹽水解酶突變體的載體，以及表達所述膽鹽水解酶突變體的的基因工程菌。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌為大腸桿菌，是將含有編碼所述膽鹽水解酶突變體的基因與表達載體連接后轉化大腸桿菌。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌是pET-20b(+)為載體、E.coli BL21(DE3)為宿主表達所述突變體。

本發明的第三個目的是提供一種生產膽鹽水解酶的方法，是利用編碼所述膽鹽水解酶突變體的核苷酸片段、含有所述膽鹽水解酶突變體的載體或者表達所述膽鹽水解酶突變體的基因工程菌。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是將表達所述膽鹽水解酶突變體的基因工程菌誘導培養后收集菌體，并破壁純化獲得；所述破壁純化是收集菌體后，用0.1M、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌離心2次，并重懸，超聲破碎5min，離心收集上清液，經過鎳柱親和柱層析和截留分子量為10kDa的超濾膜進行純化濃縮，獲得單一重組蛋白。

所述誘導培養，是培養種子液，按接種量為1％接種到TB液體培養基中，37℃培養；菌體長到OD₆₀₀為0.5-0.6時，加入IPTG誘導，并將培養溫度降到20℃，培養24h。