[發明專利]一種微生物谷氨酰胺轉氨酶的分離純化方法

有效

• 申請號: 201610070332.6
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105754892B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 金明飛;常忠義;高紅亮;易正芳;王志珍;沈迎輝;陳旭;宋佳雯;步國建
• 申請（專利權）人: 華東師范大學;泰興市東圣生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/10;C12R1/625
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發明公開一種新的微生物谷氨酰胺轉氨酶的分離純化方法，將自然篩選得到的新的菌株編號為CGMCC No.10804的茂源鏈霉菌發酵液經酒精沉淀后，進行陰離子交換層析，再經過脫鹽、冷凍干燥后得到所述的微生物谷氨酰胺轉氨酶。所得到的谷氨酰胺轉氨酶純度≧90％，內毒素水平≦0.02EU/mL，比酶活在25?30U/mg之間，回收率≧70％。本發明工藝簡單，成本低，酶活回收率高，得到的谷氨酰胺轉氨酶純度高，且此菌株發酵得到的微生物谷氨酰胺轉氨酶性質穩定，便于工業化生產，為滿足醫藥級的MTGase的規?；a提供了一條切實可行的方法。

技術領域

本發明屬于生物技術的分離純化領域，具體涉及一種新的菌種所產谷氨酰胺轉氨酶的分 離純化技術。

背景技術

谷氨酰胺轉氨酶(Transglu_tami_nase，簡稱TGase，EC2.3.2.13)是一種催化酰基轉移的轉 移酶，可催化蛋白質分子內和分子間ε-(γ-glutaminyl)lysine共價鍵的形成，從而催化蛋白 質分子內、分子間發生交聯，進而改變蛋白質的性質和功能。

谷氨酰胺轉氨酶廣泛存在于植物、動物和微生物中。最早由學者在豚鼠肝臟中獲得TGase， 其在歐洲很長一段時間作為商業TGase的來源。資源稀有和動物來源的TGase復雜的分離純 化工藝導致酶的價格非常高，以至于不可能應用于工業規模的食品加工中。所以一些學者開 始致力于從微生物中獲得這種酶。后來Ando等最早從輪枝鏈霉菌培養基中發現微生物谷氨 酰胺轉胺酶(microbial transglutaminase，MTGase)，從而實現了大規模的發酵生產。同時微 生物來源的谷氨酰胺轉氨酶較動植物來源的谷氨酰胺轉氨酶有很多優點，如微生物來源的谷 氨酰胺轉氨酶是鈣非依賴性酶，底物特異性低。這些性質使得MTGase在各個領域得到廣泛 的應用。

從1989年Ando等從輪枝鏈霉菌培養基中得到了谷氨酰胺轉氨酶以后，專家學者們陸陸 續續發現其他產TGase的鏈霉菌，如吸水鏈霉菌和茂源鏈霉菌等。不同鏈霉菌屬來源的 MTGase甚至同屬不同種的鏈霉分泌的MTGase的性質也不完全相同。它們的熱穩定性及pH 穩定性有著很大的差異，從而影響后期的應用。目前篩選到的產MTGase的鏈霉菌并不是所 有都可以轉化到工業生產中。所以篩選到產酶效率高，MTGase穩定性高的鏈霉菌的任務迫 在眉睫。而本發明中所提到的從自然界篩選到的茂源鏈霉菌所產的MTGase穩定性較之前的 發現都要高。

目前微生物來源的MTGase已經運用于工業化生產中。微生物經過發酵產生的MTGase 經過簡單的酒精沉淀后就可以運用于食品加工中。但這種方法得到的MTGase純度低，雜質 含量多且組分復雜。有研究發現，MTGase在生物制藥領域有巨大的應用前景。比如MTG可 以催化I型膠原蛋白發生交聯，形成耐高溫的膠；也可以交聯明膠，形成良好的多孔網狀物 用于止血和傷口粘合(中國專利：200780051215.4、200980131973.6；美國專利:8133484；歐 洲專利：WO2012017415、EP2303344)；因此微生物谷氨酰胺轉胺酶可作為潛在醫用止血材 料的交聯劑用于止血、傷口粘合等外科手術中。但是，運用于食品領域的MTGase的純度并 不滿足醫藥級別的要求。同時現有的傳統分離純化工藝復雜，成本高，制備過程中酶的得率、 純度以及比活力都不高，仍含有多種雜蛋白，難以滿足作為醫用材料的要求。本發明克服了 目前存在的問題，得到了一條簡單成本低的純化工藝。

發明內容

本發明的目的在于提供一種成本低、回收率高、純度高、適用于工業化生產且滿足醫藥 級要求的微生物谷氨酰胺轉胺酶純化方法，解決目前谷氨酰胺轉胺酶純化工藝復雜、成本高、 回收率低、純度低的問題。本發明方法分離純化得到的微生物谷胺酰胺轉胺酶符合醫藥級的 要求。