[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效玉米骨干自交系遺傳轉(zhuǎn)化的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610069994.1
• 申請(qǐng)日: 2016-02-01
• 公開（公告）號(hào): CN105567730A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賴錦盛;宋偉彬;趙海銘
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H4/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;何葉喧

1.一種玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟：

(1)將含有目的基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌；

(2)取步驟(1)得到的重組農(nóng)桿菌，對(duì)玉米自交系的外植體進(jìn)行侵染；

(3)完成步驟(2)后，取所述外植體，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，進(jìn)行共培養(yǎng)；

(4)完成步驟(3)后，取所述外植體，置于恢復(fù)培養(yǎng)基Ⅰ，進(jìn)行初次恢復(fù)培養(yǎng)；

(5)完成步驟(4)后，取所述外植體，依次在篩選培養(yǎng)基Ⅰ和篩選培養(yǎng)基Ⅱ上 進(jìn)行培養(yǎng)，獲得抗性愈傷組織；

(6)完成步驟(5)后，取所述抗性愈傷組織，置于恢復(fù)培養(yǎng)基Ⅱ，進(jìn)行二次恢 復(fù)培養(yǎng)；

(7)完成步驟(6)后，取所述抗性愈傷組織，置于分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得 幼苗；

(8)完成步驟(7)后，取所述幼苗置于生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得玉米自交系 轉(zhuǎn)化苗。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

每1L所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基包括：MS鹽3.90～4.80g、煙酸1.2～1.4mg、VB₁0.23～ 0.28mg、VB₆0.23～0.28mg、泛酸鈣0.23～0.28mg、鹽酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖 27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、2,4-D0.45～0.55mg、6-BA0.009～0.011mg、 植物凝膠3.15～3.85g和90～110μmol乙酰丁香酮，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的溶劑為水， 所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.4～6.0；

每1L所述恢復(fù)培養(yǎng)基Ⅰ包括：MS鹽3.90～4.80g、煙酸1.2～1.4mg、VB₁0.23～ 0.28mg、VB₆0.23～0.28mg、泛酸鈣0.23～0.28mg、鹽酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖 27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、2,4-D0.45～0.55mg、6-BA0.009～0.011mg、 植物凝膠3.15～3.85g、特美汀90～110mg和AgNO₃3.1～3.7mg，所述恢復(fù)培養(yǎng)基Ⅰ的溶 劑為水，所述恢復(fù)培養(yǎng)基Ⅰ的pH值為5.4～6.0；

每1L所述篩選培養(yǎng)基Ⅰ包括：MS鹽3.90～4.80g、煙酸1.2～1.4mg、VB₁0.23～ 0.28mg、VB₆0.23～0.28mg、泛酸鈣0.23～0.28mg、鹽酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖 27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、2,4-D0.45～0.55mg、6-BA0.009～0.011mg、 植物凝膠3.15～3.85g、特美汀90～110mg、雙丙氨膦1.35～1.65mg和AgNO₃3.1～3.7mg， 所述篩選培養(yǎng)基Ⅰ的溶劑為水，所述篩選培養(yǎng)基Ⅰ的pH值為5.4～6.0；

每1L所述篩選培養(yǎng)基Ⅱ包括：MS鹽3.90～4.80g、煙酸1.2～1.4mg、VB₁0.23～ 0.28mg、VB₆0.23～0.28mg、泛酸鈣0.23～0.28mg、鹽酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖 27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、2,4-D0.45～0.55mg、6-BA0.009～0.011mg、 植物凝膠3.15～3.85g、特美汀90～110mg、雙丙氨膦2.7～3.3mg和AgNO₃3.1～3.7mg， 所述篩選培養(yǎng)基Ⅱ的溶劑為水，所述篩選培養(yǎng)基Ⅱ的pH值為5.4～6.0；

每1L所述恢復(fù)培養(yǎng)基Ⅱ包括：MS鹽3.90～4.80g、煙酸1.2～1.4mg、VB₁0.23～ 0.28mg、VB₆0.23～0.28mg、泛酸鈣0.23～0.28mg、鹽酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖 27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、6-BA3.15～3.85mg、毒莠定0.9～1.1mg、植 物凝膠3.15～3.85g、特美汀90～110mg和雙丙氨膦1.35～1.65mg，所述恢復(fù)培養(yǎng)基Ⅱ 的溶劑為水，所述恢復(fù)培養(yǎng)基Ⅱ的pH值為5.4～6.0；

每1L所述分化培養(yǎng)基包括a1)或a2)：

a1)MS鹽3.90～4.80g、煙酸1.2～1.4mg、VB₁0.23～0.28mg、VB₆0.23～0.28mg、 泛酸鈣0.23～0.28mg、鹽酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖10～15g、葡萄糖15～20g、L- 脯氨酸0.63～0.77g、植物凝膠3.15～3.85g、酪蛋白水解物0.18～0.22g、甘氨酸 0.036～0.044g、肌醇0.09～0.11g和雙丙氨膦2.7～3.3mg，

a2)蔗糖27.0～33.0g、L-脯氨酸0.63～0.77g、植物凝膠3.15～3.85g、KNO₃2547～ 3113mg、(NH₄)₂SO₄417～509mg、KH₂PO₄360～440mg、MgSO₄·7H₂O167～204mg、CaCl₂·2H₂O 149～183mg、MnSO₄·H₂O6.8～8.4mg、ZnSO₄·7H₂O1.8～2.2mg、H₃BO₃2.7～3.3mg、 KI0.68～0.83mg、Na₂MoO₄·2H₂O0.23～0.28mg、CuSO₄·5H₂O0.023～0.028mg、CoCl₂·6H₂O 0.023～0.028mg、乙二胺四乙酸鈉鐵鹽32.9～40.1mg、氯化膽堿0.088～0.108mg、 VB₂0.044～0.054mg、D-生物素0.09～0.11mg、煙酸0.18～0.22mg、葉酸0.0437～ 0.0534mg、VB₁0.425～0.519mg、D-泛酸鈣0.09～0.11mg、VB₆0.18～0.22mg、VB₁₂0.0014～0.0017mg、對(duì)氨基苯甲酸0.044～0.054mg、酪蛋白水解物0.18～0.22g、甘氨 酸0.036～0.044g、肌醇0.09～0.11g和雙丙氨膦2.7～3.3mg，

所述分化培養(yǎng)基的溶劑為水，所述分化培養(yǎng)基的pH值為5.5～6.1；

每1L所述生根培養(yǎng)基包括：MS鹽1.949～2.382g、蔗糖27.0～33.0g、植物凝膠 3.15～3.85g和雙丙氨膦2.7～3.3mg，所述生根培養(yǎng)基的溶劑為水，所述生根培養(yǎng)基 的pH值為5.4～6.0。