[發明專利]LDL受體基因敲除的基因工程倉鼠

在審

• 申請號: 201610069985.2
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN107022572A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 張海峰
• 申請（專利權）人: 河北伊維沃生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 石家莊元匯專利代理事務所(特殊普通合伙)13115
• 代理人: 周大偉

技術領域

本發明涉及基因工程動物領域，更具體地說，涉及通過CRISPR/CAS9基因編輯技術構建的LDL受體基因敲除的倉鼠。

背景技術

高膽固醇血癥(hypercholesterolemia)是動脈粥樣硬化和心血管疾病最重要的獨立危險因子之一，并與諸多遺傳和環境因素有相互作用。家族型高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia)是原發性高膽固醇血癥之一，其發病機理主要是低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受體的基因突變功能下降或喪失，血漿LDL清除減慢，膽固醇水平升高，導致早發性心腦血管疾病并常伴有皮膚和肌腱黃色瘤(1,2)。

選擇恰當的疾病動物模型是研究人類疾病發生、發展及轉歸，藥物篩選及藥理學研究的必然手段。小鼠因其體積小、繁殖快、費用低，更因為有多種基因工程模型，因此廣泛用于各種疾病的實驗研究。小鼠對動脈粥樣硬化不易感，以往基本不用于動脈粥樣硬化的研究；直至載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)(3)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDL-R)基因敲除小鼠(4)的問世，小鼠迅速變成了代謝性心血管病研究領域中最常用的模式動物。apoE和LDL-R純合子KO小鼠可以自發動脈粥樣硬化病變(5)，高脂飼料可加速這種病變的發生。然而由于小鼠脂代謝與人類差異較大，對藥物的敏感性不同，一些基于小鼠取得的研究結果在臨床應用上存在一定爭議(6)。此外，小鼠動脈粥樣病變多發于主動脈和流出道，極少累及冠脈和腦動脈。因此，基于apoE KO和LDL-R KO小鼠高膽固醇血癥的心腦血管并發癥的研究，缺乏冠狀動脈和腦動脈病變的基礎病因和病生理基礎，不能模擬人類冠心病和中風的自然發病過程，有明顯局限性。

發明內容

本發明一方面提供了一種基因工程倉鼠，其中該倉鼠體內的LDL受體基因被敲除。

在一些實施方案中，該倉鼠為LDL受體基因敲除純合子。在另一些實施方案中，該倉鼠為LDL受體基因敲除雜合子。

在一些實施方案中，該倉鼠的血脂水平顯著升高。

本發明另一方面提供了一種制備基因工程倉鼠的方法，包括：將該倉鼠體內的LDL受體基因敲除。

在優選實施方案中，所述LDL受體基因通過CRISPR/CAS9基因編輯技術被敲除。在一些具體實施方案中，其中所采用的sgRNA序列為倉鼠LDL受體基因的互補序列，其靶向LDL受體基因為第二外顯子。例如，在一個實施方案中，所采用的 CRISPR-Forward和sgRNA-Reverse序列分別如SEQ ID NO:2和3所示。

在一些實施方案中，該倉鼠為LDL受體基因敲除純合子。在另一些實施方案中，該倉鼠為LDL受體基因敲除雜合子。

本發明另一方面提供了一種篩選用于治療人類心血管疾病的藥物的方法，包括以下步驟：

a)將候選藥物給予LDL受體基因被敲除的基因工程倉鼠，

b)測定給藥之前和給藥之后所述基因工程倉鼠體內的血脂水平，以及

c)如果所述基因工程倉鼠體內的血脂水平在給藥之后顯著降低，則所述候選藥物被評定為有效。

在一些實施方案中，所述心血管疾病可以選自由高脂血癥、高膽固醇血癥和動脈硬化癥構成的組。

在一些實施方案中，所述血脂水平可以為血液膽固醇水平和/或甘油三酯水平。

在一些實施方案中，該倉鼠為LDL受體基因敲除純合子。在另一些實施方案中，該倉鼠為LDL受體基因敲除雜合子。

本發明另一方面提供了所述基因工程倉鼠在篩選藥物中的應用，其中所述藥物用于治療人類心血管疾病。

在一些實施方案中，所述心血管疾病選自由高脂血癥、高膽固醇血癥和動脈硬化癥構成的組。

附圖說明

圖1顯示了LDL-R基因敲除倉鼠的構建。(A)引導RNA在LDL-R基因第二外顯子上識別位點示意圖，其中藍色字體為識別序列，紅色字體為PAM序列。(B)兩只構建成功乳鼠的LDL-R基因序列片段，其中藍色字體為識別序列，紅色字體為PAM序列，綠色字體為點突變序列，虛線部分為缺失序列，突變類型標注于每行末端。(C)LDL-R缺失Δ194bp倉鼠組織經PCR擴增后的DNA凝膠電泳圖，缺失片段DNA長度為394bp。