[發明專利]一種海洋菌株及其胺脫氫酶催化制備手性胺的方法

有效

• 申請號: 201610069548.0
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105567756B
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 王世珍;方柏山;任紅;林鵬
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12P13/02
• 分類號: C12P13/02;C12R1/38
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

1.一種海洋菌株催化制備手性胺的方法，其特征在于：利用巴利阿里假單胞菌(Pseudomonas balearica)進行培養，制備全細胞或粗酶液；以酮為底物，加入氨基供體以及輔助底物用于輔酶循環再生，利用全細胞或者粗酶液催化不對稱還原胺化得到產物手性胺；包括：

1)菌株的培養：將巴利阿里假單胞菌(Pseudomonas balearica)以1％的接種量接種入216L培養基中培養；所述巴利阿里假單胞菌(Pseudomonas balearica)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC編號為8967；所述216L培養基組成為10.0g/L蛋白胨,5.0g/L酵母粉,0.5g/L牛肉膏,0.5g/L檸檬酸鈉,0.2g/L NH₄NO₃,1.0g/L醋酸鈉，用海水配置；

2)全細胞的制備：將步驟1)培養結束獲得的發酵液，離心獲得細胞，棄上清液，沉淀重懸，充分洗滌后離心，重復上述沉淀重懸-洗滌-離心若干次，獲得細胞；將細胞用緩沖液配制成25～5000mg/L的細胞液；

或

2’)粗酶液的制備：將步驟1)培養結束獲得的發酵液，離心獲得細胞，棄上清液，沉淀重懸，充分洗滌后離心，重復上述沉淀重懸-洗滌-離心若干次，獲得細胞；細胞用超聲破碎儀破碎后離心，得到含有胺脫氫酶的粗酶液，用緩沖液調節粗酶液濃度至5～1500mg/L；

3)全細胞催化：以步驟2)得到的25～5000mg/L的細胞液為基礎配制全細胞催化體系：0.001～0.05mol/L酮，0.002～0.2mol/L氨基供體，0.001～0.2mol/L輔助底物，0.01～0.2mol/L的緩沖液，25～5000mg/L的細胞，反應體系pH 7～13，在0℃～70℃反應溫度下，100～300rpm震蕩反應，反應時間30～180小時，利用全細胞催化不對稱還原胺化得到產物手性胺；

或

3’)粗酶液催化：以步驟2’)得到的5～1500mg/L的粗酶液為基礎配制粗酶液催化體系：0.001～0.05mol/L酮，0.002～0.2mol/L氨基供體，0.001～0.2mol/L輔助底物，0.01～0.2mol/L的緩沖液，5～300mg/L的粗酶液，反應體系pH 8～12，在10℃～70℃反應溫度下，100～300rpm震蕩反應，反應時間10～90小時，利用粗酶液催化不對稱還原胺化得到產物手性胺。

2.根據權利要求1所述的一種海洋菌株催化制備手性胺的方法，其特征在于：所述的酮為通式Ⅰ所示的脂肪酮、芳香酮和羥基酮：

其中R₁，R₂是C2～10的烷基、芳香基或羥基。

3.根據權利要求2所述的一種海洋菌株催化制備手性胺的方法，其特征在于：所述的脂肪酮的分子式為C_xH_yO，其中x為4～7，y為8～14，酮的分子量為72～115。

4.根據權利要求1所述的一種海洋菌株催化制備手性胺的方法，其特征在于：所述的氨基供體為丙氨酸、氨水、NH₄Cl、NH₄NO₃或氨基烷烴中的一種或多種。

5.根據權利要求1所述的一種海洋菌株催化制備手性胺的方法，其特征在于：所述的輔助底物為濃度0.001～0.2mol/L的葡萄糖、甘油、乙醇、甲酸、異丙醇、仲丁醇中的一種或多種。

6.根據權利要求1所述的一種海洋菌株催化制備手性胺的方法，其特征在于：所述緩沖液為pH為7～13的Tris-鹽酸、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸鉀中的一種或多種。

7.根據權利要求1所述的一種海洋菌株催化制備手性胺的方法，其特征在于：所述步驟1)中，培養條件為：起始pH 6.0～8.0，裝液量體積分數為5％～30％，培養溫度25～35℃，搖床轉速100～300rpm，培養時間24～72小時。