[發(fā)明專利]一種重組腺相關(guān)病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610069162.X
• 申請(qǐng)日: 2016-02-01
• 公開（公告）號(hào): CN105586320A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫振華;曹暉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 厚樸生物科技(蘇州)有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/01
• 分類號(hào): C12N7/01;C12N15/864;C07K14/47
• 代理公司: 北京眾元弘策知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11462
• 代理人: 孫東風(fēng)

1.一種重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，所述重組腺相關(guān)病毒是通過將腫瘤抗原基因插 入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，形成的重組腺相關(guān)病毒。

2.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將腫瘤抗原基因插入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，使所述腫瘤抗原基因進(jìn)入包含 ITR的載體，形成重組質(zhì)粒；

(2)大量抽提步驟1)中所述的重組質(zhì)粒，與pHelper和pAAV-RC質(zhì)粒采用磷酸鈣沉淀法 共同轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，培養(yǎng)2--3天，收集培養(yǎng)基和細(xì)胞，采用反復(fù)凍融法收集粗病毒液。

3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將腫瘤抗原基因插入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，使所述腫瘤抗原基因進(jìn)入包含 ITR的載體，形成重組質(zhì)粒；

(2)從生產(chǎn)病毒的細(xì)胞中純化AAV2病毒顆粒，細(xì)胞經(jīng)AAVproExtractionSolution初 步純化后，利用核酸酶進(jìn)行處理，然后讓AAV2顆粒與預(yù)裝柱結(jié)合，經(jīng)過洗滌和洗脫，即可得 到高純度的AAV顆粒。

4.一種權(quán)利要求1中所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)：使所述重組腺相關(guān)病毒感染DC細(xì)胞，并在DC細(xì)胞中表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法，其特征在于，還包括以下步驟 (2)：采用siRNA干擾方式沉默PD-1基因，阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法，其特征在于，所述步驟(2)具體 為：

a)將具有SEQIDNo.1所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-1、具有SEQIDNo.2所示的序列結(jié)構(gòu) 的siRNA-2、具有SEQIDNo.3所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-3，上述三對(duì)針對(duì)PD-1mRNA的siRNA 作用靶點(diǎn)，合成發(fā)夾樣的兩端配對(duì)siRNA的模板DNA，中間以6個(gè)脫氧核苷酸的LOOP相連，分 別在3’端加入終止信號(hào)polyT，兩端分別加入限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI的酶切位點(diǎn)粘性 末端，同時(shí)合成互補(bǔ)DNA鏈；

b)將具有SEQIDNo.4所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-1-1、具有SEQIDNo.5所示的序列結(jié) 構(gòu)的siRNA-1-2、具有SEQIDNo.6所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-2-1、具有SEQIDNo.7所示的 序列結(jié)構(gòu)的siRNA-2-2、具有SEQIDNo.8所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-3-1、具有SEQIDNo.9 所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-3-2插入載體；

c)合成ShRNA的模板DNA雙鏈，構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法，其特征在于，所述步驟(2)中所 述的6個(gè)脫氧核苷酸具有SEQIDNo.10所示的序列結(jié)構(gòu)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法，其特征在于，所述步驟c)具體 為：首選將合成的引物干粉溶解于退火緩沖液中，置于90℃的水浴中15min，然后自然冷卻 至室溫備用；vshRNA載體質(zhì)粒lenti-gag-shRNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI酶切后以使 其線性化，插入片斷所述siRNA-1-1、siRNA-1-2、siRNA-2-1、siRNA-2-2、siRNA-3-1、siRNA- 3-2，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，陽性克隆經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序鑒定，構(gòu)建質(zhì)粒。