[發(fā)明專利]PRRSV美洲型經(jīng)典株數(shù)字PCR絕對定量檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610069032.6
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105483294A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳晨;翟新驗;吳佳俊;原霖;張碩;韓燾;周智;倪建強(qiáng);劉穎昳;訾占超;徐琦;李碩;王靜;馬付坤
• 申請（專利權(quán)）人: 北京佰鷗創(chuàng)投生物科技有限公司;中國動物疫病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京智為時代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及試劑盒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種豬繁殖與呼 吸綜合征病毒美洲型經(jīng)典株數(shù)字PCR絕對定量檢測方法和檢測試劑 盒。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductive andrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一種以懷孕母豬繁殖障 礙、尤其哺乳仔豬呼吸困難為特征的高度接觸性傳染病。本病在1987 年首次暴發(fā)于美國，隨后在加拿大、歐洲與亞洲相繼出現(xiàn)，目前已經(jīng) 在世界范圍內(nèi)流行，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國在1995年首次出 現(xiàn)PRRS，隨后迅速蔓延。2006年在我國全面暴發(fā)了體溫高、發(fā)病率 高、死亡率高為主要臨床特征的豬“高熱病”，而導(dǎo)致該病的病原是較 之前在國內(nèi)流行的經(jīng)典PRRSV發(fā)生變異的高致病性豬繁殖與呼吸綜 合征病毒(highlypathogenicPRRS，HP-PRRS)。目前為止，PRRSV 有兩種型，歐洲型和美洲型，而美洲型又分為兩種亞型，經(jīng)典美洲株 和高致病性美洲株，三種亞型毒株在基因序列上存在一定差異。我國 國內(nèi)主要流行的為美洲型毒株，而歐洲株在國內(nèi)也偶有發(fā)現(xiàn)，因此在 臨床上需要一種能夠快速診斷PRRSV美洲型經(jīng)典株的檢測方法。

傳統(tǒng)的PRRSV檢測方法主要包括病毒的分離與鑒定、免疫過氧 化物酶單層實驗(IPMA)、間接免疫熒光實驗(IFA)和間接酶聯(lián)免疫 吸附實驗(間接ELISA)等。目前最常用核酸檢測方法有反轉(zhuǎn)錄-聚合 酶鏈反應(yīng)實驗(RT-PCR)和熒光RT-PCR(RealtimeRT-PCR)等實驗。 傳統(tǒng)的PRRSV檢測方法存在需要使用高成本儀器設(shè)備，試驗所需時 間較長等不足。RT-PCR和RealtimeRT-PCR雖然較之以往方法具有 特異性更強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，且自動化程度高等特點，但是上 述方法均只能實現(xiàn)定性和半定量的檢測，無法對病毒核酸進(jìn)行精確定 量，在靈敏度和敏感性特異性上仍存在一定的局限性。

數(shù)字化PCR(DigitalPCR，dPCR)的概念早在1999年就由Bert Vogelstein采用并發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)，其初衷是為了能夠從臨床樣品(如 尿液、淋巴液、血漿、糞便等)大量的正常體細(xì)胞中檢測出微量的突 變細(xì)胞，但由于當(dāng)時能用于稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此還不 能非常好地體現(xiàn)數(shù)字PCR的核心理念——“無限稀釋”(terminal dilution)。Bio-Rad公司的QX200系統(tǒng)核心的微滴化技術(shù)能夠?qū)⒁环輼? 品分成20,000個納升級的微滴，本質(zhì)上將傳統(tǒng)定量PCR的一個test變成 20,000個test，大大提高了核酸序列檢測的靈敏度和精準(zhǔn)度，是對“無 限稀釋”這一概念的完美演繹，其方法原理可稱為微滴式數(shù)字化PCR (DropletDigitalPCR，ddPCR)。QX200ddPCR系統(tǒng)包括兩臺儀器： 微滴發(fā)生器和微滴分析儀，及其相關(guān)的耗材。微滴發(fā)生器將每個樣品 分成20,000個均勻的納升級微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分 子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。每個微滴都作為一個獨立 的PCR反應(yīng)器。隨后微滴轉(zhuǎn)移至96孔PCR板上，開展終點PCR擴(kuò)增。 采用微滴分析儀(dropletreader)逐個對每個微滴進(jìn)行檢測，有熒光 信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，最終根據(jù)泊松分 布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度 或拷貝數(shù)。與傳統(tǒng)的定量PCR相比，數(shù)字PCR的精確度和靈敏度更佳。 利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，研究人員可以檢測稀有突變，精確測定拷 貝數(shù)變異，并對基因表達(dá)進(jìn)行絕對定量。癌癥相關(guān)突變因濃度較低， 往往逃過檢測。憑借QX200系統(tǒng)的高靈敏度，研究人員如今可檢測濃 度低至1/1,000,000的靶分子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、 高精確度、可實現(xiàn)精確定量的數(shù)字PCR檢測方法和數(shù)字PCR檢測試劑 盒，用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經(jīng)典株的快速精確檢測。

本發(fā)明的第一個技術(shù)目的是提供用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征 病毒美洲型經(jīng)典株的特異性引物和探針組合，包括1對特異性引物和 1條與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列分別為：

F：TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC