[發明專利]一種奶牛金黃色葡萄球菌α-溶血素亞單位疫苗的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201610068723.4
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105646681B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 錢泓;吳有強;宣春玲;查銀河;賈寶琴;曹珊珊;陳藻
• 申請（專利權）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/31
• 分類號: C07K14/31;A61K39/085;A61P15/14
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產權代理有限責任公司 11042
• 代理人: 付曉青

本發明公開了一種奶牛金黃色葡萄球菌α?溶血素亞單位疫苗的制備方法及應用。目的在于提供預防或治療奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法,包括以下步驟：1)將金黃色葡萄球菌α?溶血素蛋白的第37位的組氨酸定點突變為丙氨酸；2)將定點突變的α?溶血素蛋白基因克隆到pET28a載體中；3)將步驟2)獲得的表達載體轉化E.coli BL21(DE3),誘導表達獲得重組α?溶血素蛋白；4)使用鎳柱親和層析和Resource S柱純化步驟3)得到的重組α?溶血素蛋白；5)將純化得到的重組α?溶血素蛋白與藥學上可接受的佐劑充分混勻后得到奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎重組亞單位疫苗。

技術領域

本發明涉及一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法及應用。屬于生物疫苗制備技術領域。

背景技術

奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病，主要是奶牛乳腺組織受到微生物感染而引起的一種炎癥，多發生于產后哺乳期，該病廣泛存在于世界各地，為奶牛常見病、多發病，是造成乳制品業經濟損失最為嚴重的疾病。引起奶牛乳房炎的病原微生物大約有150多種，主要以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌為主，這三種細菌引起的奶牛乳房炎占總發病率的90％以上，其中尤以金黃色葡萄球菌為最。

當前奶牛乳房炎的治療方法主要是采用抗生素治療，抗生素用于治療奶牛乳房炎已有50多年的歷史了，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于長期單一的、大劑量的不科學使用抗生素，引起了敏感性細菌的消除，耐藥性細菌逐漸占了主流，尤其是金黃色葡萄球菌的耐藥問題日益嚴重，導致了抗生素治療收效甚微。

用疫苗來防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以預防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的嚴重程度，控制亞臨床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不會存在乳汁中抗生素殘留問題；最后是操作簡便，費用低廉。當前，研制成功的疫苗很少，且大都數為弱毒活菌苗或滅活菌苗，在生產實踐中，對乳房炎的防治有一定作用，然而隨著大規模集約化養殖的發展，人工致弱菌株存在著同源重組、自身毒力返強等潛在可能，而滅活疫苗也存在使用劑量大、免疫期短等不足，為提高傳統疫苗的安全性與免疫保護力，高效、廉價的新型疫苗研制極其重要。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，簡稱SA)，也稱“金葡菌”，是一種革蘭氏 染色陽性的球菌，直徑0.8μm，在顯微鏡下排列成葡萄串狀，并可以產生金黃色的色素，并 因此而得名。金葡菌是引起慢性/隱性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以極大的影響牛奶的 產量和質量，給奶制品產業帶來巨大的經濟損失。

金葡菌可產生多種毒素和酶。α-溶血素(α-hemolysin)，亦稱α-toxin，是由金葡菌分泌的一種外毒素，是其主要毒力因子之一，具有良好的免疫原性。α-溶血素屬于中空形狀的β-桶狀結構細菌毒素家族，相對分子質量為33,200，由297個氨基酸組成，其結構基因為h/a。α-溶血素對多種哺乳動物紅細胞具有溶血作用，其機理為毒素分子插入紅細胞的細胞 膜疏水區，形成微孔，破壞了細胞膜的完整性，造成細胞溶解。將α-溶血素第35位組氨酸突 變為丙氨酸后，突變體就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直 接用來免疫動物，是金葡菌亞單位疫苗的重要候選蛋白之一。

發明內容

本發明的目的在于提供一種奶牛金黃色葡萄球菌α-溶血素亞單位疫苗的制備方法 及應用。重組蛋白與合適佐劑混合制備的亞單位疫苗與致病菌的自然感染過程相似，可促進 細胞免疫，誘導免疫記憶和引起廣泛的免疫應答，產生很好的交叉保護反應，是一種更加安 全穩定、制備簡單、應用方便、價格低廉的新型疫苗。

所述的重組α-溶血素蛋白來自金黃色葡萄球菌，編碼該蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。