[發明專利]一種利用微生物發酵生產10-脫乙酰巴卡亭III的方法

有效

• 申請號: 201610068684.8
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105524954B
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 駱健美;王敏;朱鳳芝;楊亞男;王立爽;魏雪琴;申雁冰;鄭宇
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12P17/02
• 分類號: C12P17/02;C12R1/01
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

本發明涉及一種利用微生物發酵生產10?脫乙酰巴卡亭III的方法，采用Tolumonas osonensis為發酵菌種，經一級種子培養、二級發酵培養，在得到的菌體發酵液中投入底物巴卡亭III，進行C10?脫乙酰基反應轉化，生成10?DAB，菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCCNo.7562。本發明以巴卡亭III作為底物采用微生物一步C10?脫乙酰基反應生物合成10?DAB，具有操作簡單、反應專一性好、成本低、反應條件溫和、產物易于分離純化等優點，克服了現有方法步驟繁瑣、收率低、副產物多、分離純化困難、環境不友好等缺點。

技術領域

本發明屬于微生物制藥及醫藥工程領域，具體涉及到一種利用Tolumonasosonensis生產10-脫乙酰巴卡亭III的方法，該方法以Tolumonas osonensis CGMCCNo.7562為菌種，以巴卡亭III為底物，采用微生物C10-脫乙酰基反應轉化生產10- 脫乙酰巴卡亭III的方法。

背景技術

10-脫乙酰巴卡亭III(10-DAB)是紫杉烷類抗腫瘤藥物的典型代表--多烯紫杉醇的前體物質。它廣泛分布于紅豆杉植物的樹葉、根、皮、枝干中，在不同種植物的含量差異較大，但總體含量偏低，一般在0.00513％-0.175％左右。其傳統制備方法是從植物中進行提取，但此過程工藝步驟冗長、需要經過多次層析、梯度洗脫、多次重結晶后才能獲得精制品，不僅造成了10-DAB的大量損失，降低了收率，而且過程中還大量使用乙腈和石油醚等有機溶劑，對環境造成不良影響。

微生物轉化是指某一微生物將一種物質(底物)轉化成為另一種物質(產物)的過程，其本質是利用生物體所產生的酶對外源化合物進行酶催化反應，它具有反應選擇性強(位置選擇性、立體選擇性)、反應條件溫和、副產物少和不造成環境污染等優點。Tolumonasosonensis是2011年Matthew等人發現的屬于甲苯單胞菌屬的一個新種，目前利用該菌株轉化巴卡亭III生產10-脫乙酰巴卡亭III的研究還未見報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種工藝簡單、副產物少、經濟實用、反應條件溫和且對環境友好的生產10-DAB的方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種利用微生物發酵生產10-脫乙酰巴卡亭III的方法，采用Tolumonasosonensis為發酵菌種，經一級種子培養、二級發酵培養，在得到的菌體發酵液中投入底物巴卡亭III，進行C10-脫乙酰基反應轉化，生成10-DAB，所述的Tolumonas osonensis由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏 ，保藏 編號為CGMCC No.7562。

而且，所述的在制成的菌體發酵液投入巴卡亭III進行C10-脫乙酰基反應的方式是：用有機溶劑將巴卡亭III助溶，配制成的溶液加入到菌體發酵液中，巴卡亭III投入的終濃度為0.04-1g/L，有機溶劑加入的體積比例為2-25％。

而且，所述的有機溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯的其中一種。

而且，所述的C10-脫乙酰基反應的轉化條件是：28-37℃、150-300r/min轉化培養60-144h。

而且，所述的Tolumonas osonensis的一級種子培養的方式是：將Tolumonasosonensis CGMCC No.7562在斜面上培養，22℃-30℃下恒溫培養2-5d后，取一滿環至種子培養基中，22℃-30℃、120-280r/min振蕩培養18-30h，得到適于接種的種子培養液。

而且，所述的Tolumonas osonensis的二級發酵培養的方式是：將種子培養液以5％-15％的接種量接入發酵培養基，22℃-30℃、120-280r/min振蕩培養20-32h進行二級發酵培養，得到菌體發酵液。