[發(fā)明專利]松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因克隆及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610068635.4
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN106987567A
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡紫玲;林同;吳華俊;劉琪司;陳敬祥
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因序列克隆的方法，依次包括下列步驟：

1)松墨天牛總RNA的提取

對松墨天牛解剖并取出成蟲的頭部、胸部、腹部、觸角、足、翅、體壁等樣品和幼蟲的脂肪體、血淋巴、中腸、馬氏管等樣品，并將各樣品迅速用液氮處理，置于-70℃?zhèn)溆谩＠肊.Z.N.A.^TMTotal RNA Kit II總RNA提取試劑盒(OMEGA)提取各部位和各組織的總RNA；

2)引物設(shè)計和3′RACE擴(kuò)增

根據(jù)本實(shí)驗構(gòu)建的cDNA文庫中，獲得了松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因5′端序列，本發(fā)明在此基礎(chǔ)上進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增，以獲得墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因全序列；3′RACE擴(kuò)增的特異性引物為：Outer：5′-GAGTTGGTGGGATTATGGG-3′和Inner：5′-AGGACATTAGGGAAAGCG-3′：

3)目的基因克隆及測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)由瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的DNA片段，與pMD20-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行AMP抗性藍(lán)白斑篩選，挑陽性菌落提取質(zhì)粒.經(jīng)菌落PCR鑒定后測序；

4)序列拼接

將測序的序列與構(gòu)建的cDNA文庫松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因5′端序列進(jìn)行拼接，獲得松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因全長序列。

4.松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因的分布和表達(dá)

1)對松墨天牛各組織、各部位分別提取總RNA，按照PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser操作手冊進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板：將各組織、部位樣品cDNA稀釋作為模板，采用SYBR Premix Ex Taq^TM染料法，在羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析；

2)按照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq^TM試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，實(shí)驗數(shù)據(jù)采用相對ACT法分析松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B基因在各樣品中的相對表達(dá)量；

3)熒光定量PCR所用引物為：Forward(正向)：5′-CATACGGAAGCGATGGAACT-3′和Reverse(反向)：5′-CCCATAATCCCACCAACTCA-3′。