[發明專利]一種苦瓜蛋白腸溶片的制備工藝

在審

• 申請號: 201610067205.0
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105709208A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 龔國利;蔡東梅;李慧
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61K36/42;A61K9/30;C12P21/02;A61P37/02;A61P31/12;A61P35/00;A61P31/10
• 代理公司: 西安智大知識產權代理事務所 61215
• 代理人: 段俊濤

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種苦瓜蛋白腸溶片的制備工藝。

背景技術

傳統的植物藥研究思路一般為繁瑣的提取分離，最終需要從提取的復合成分中分離出具有活性的單一成分。然而植物藥的相關有效成分往往含量較低，分離步驟繁瑣，采用傳統的提取方法效率很低，會無法滿足后期的研究生產需要。當今分子生物技術已日趨成熟，利用基因工程實現某一目的產物的異源生產已經成為了新的研究熱點。近年來，隨著提取分離技術的發展，人們從苦瓜中分離到多種具有降血糖、抗突變、抗腫瘤以及提高人體免疫力等功效的核糖體失活蛋白，其中在這些苦瓜蛋白成分中，分子量為30kD的I型核糖體失活蛋白MAP30(Momordicaanti-HIVproteinof30kD)的各項性能優越，具有免疫調節、抗病毒、抗腫瘤、抗真菌作用，對人體健康十分有益，可制成一種保健藥品。但作為一種蛋白，制成普通的制劑會在胃中被消化破壞，而通過從苦瓜中利用傳統方法提取MAP30污染大，效率低，故準備先利用基因工程技術通過工程菌大規模發酵生產活性苦瓜蛋白MAP30，最終制成一種富含活性蛋白MAP30的苦瓜蛋白腸溶片。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種苦瓜蛋白腸溶片的制備工藝，采用基因工程生產高純度苦瓜蛋白MAP30，制成極具保健功能的苦瓜蛋白腸溶片；苦瓜蛋白腸溶片不僅避免了傳統苦瓜片口感差、易在胃中分解的問題，更減少了傳統苦瓜蛋白MAP30提取帶來的污染，且這種苦瓜片中有效蛋白MAP30的含量高，更能促進人體的健康。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種苦瓜蛋白腸溶片的制備工藝，包括以下步驟：

步驟一：苦瓜原料的處理：取適量的成熟苦瓜中的種子，除去種子殼，然后放入研缽中，加入適量的液氮研磨成粉末狀，分裝得到處理后苦瓜種子粉；

步驟二：苦瓜種子粉的處理：將步驟一中分裝后的苦瓜種子粉，利用CTAB法提取得到苦瓜全基因組，作為PCR反應的模板；

步驟三：PCR反應的確定：首先根據相關苦瓜蛋白MAP30的基因序列設計相關的引物，并最終確定PCR的條件及體系；

步驟四：TA克隆：PCR產物回收后進行TA克隆，并導入感受態細胞DH5α，經藍白斑篩選、菌落PCR，篩選出陽性菌落，提取目標DNA片段后進行雙酶切；

步驟五：表達載體的處理：過夜培養PET-28a，提取表達質粒，并用與步驟四相同的兩種酶進行酶切；

步驟六：連接：將用步驟四與步驟五中相同酶切的片段在solutionⅠ的體系中進行過夜連接；

步驟七：將步驟六中的過夜連接的產物導入感受態細胞BL21(DE)，經藍白斑篩選、菌落PCR，篩選出陽性菌落；

步驟八：將步驟七中篩選出的陽性菌落放大培養并在IPTG的誘導下進行苦瓜蛋白MAP30的表達；

步驟九：發酵培養后經一系列處理將步驟八得到的的苦瓜蛋白MAP30進行純化干燥；

步驟十：制腸溶片：首先將步驟九中確定發酵得到的苦瓜蛋白MAP30與輔料的比例，最后經粉碎、過篩、配料、混合、濕法制粒、顆粒干燥、壓片、包腸溶衣、包裝、儲存。

所述步驟一中苦瓜粉分裝為：每管中分裝的具體量為10-15g。

所述步驟二中CTAB法的具體過程為：將水浴鍋溫控鈕調至60℃，預熱CTAB提取緩沖液→研磨得到的苦瓜粉末轉移至10mL預熱CTAB提取緩沖液中，60℃下不時晃動離心管，保溫1h→冷卻片刻，加入10mL氯仿/異戊醇(24:1)，劇烈震蕩離心管，10000r/min離心15min→上清液轉入裝有25mL100％乙醇的新離心管，輕柔地顛倒混勻→10000r/min離心15min，棄上清，得到DNA沉淀→加700μl70％乙醇，70μl3mol/LNaAc溶液以漂洗DNA沉淀，然后轉至1.5mLEppendorf→10000r/min離心30s→再用70％乙醇漂洗DNA沉淀，離心30s，棄上清液→室溫下揮發乙醇→加入500μlTE，4℃過夜溶解DNA→加4-10μlRNaseA，顛倒混勻，并在55℃下保溫30-60min→加入1.25mL乙醇、54μlNaAc，沉淀DNA→離心30s，室溫下揮發乙醇→DNA沉淀溶解在300μlTE中。

所述步驟三中引物設計為

F15′-CGTCGACCTGTGGTATGCTTACTACTT-3′F2