[發明專利]細胞色素氧化酶CYP1A1特異性熒光探針及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201610065930.4
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN107022349B
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 楊凌;戴子茹;崔京南;葛廣波;馮磊;寧靜
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07D221/14
• 分類號: C07D221/14;C09K11/06;C12Q1/26;G01N21/64
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

1.一類細胞色素氧化酶CYP1A1特異性熒光探針，其特征在于：在生理條件下該探針底物可被CYP1A1特異性催化生成相應的去氯乙基化產物，其結構通式如下：

其中，R為-CH3、苯基、-OH中的任意一種，n為1～10。

2.一種如權利要求1所述CYP1A1特異性熒光探針的制備方法，其特征在于,該方法包括下列步驟：

步驟一：4-溴-1,8-萘二甲酸酐與氨基化合物在醇中反應得到4-溴-1,8-萘酰亞胺；

步驟二：4-溴-1,8-萘酰亞胺與碳酸鉀在有機溶劑中反應得到式(Ⅱ)所示4-甲氧基-1,8-萘酰亞胺；

步驟三：在氬氣保護下，200-500mg式(Ⅱ)所示化合物與5-20ml 50-60％氫碘酸水溶液反應,120-130℃攪拌12-24h后，加大量水稀釋，過濾，用水洗滌至濾液為中性，真空干燥得到式(Ⅲ)所示4-羥基-1,8-萘酰亞胺；

步驟四：將式(Ⅲ)所示化合物與碘代氯乙烷，碳酸鉀，在乙腈中80-90℃反應12h-24h后，旋蒸除去溶劑，殘余固體用柱層析法提純，真空干燥得到式(Ⅰ)所示化合物；

所述反應中化合物Ⅲ與碘代氯乙烷及碳酸鉀摩爾比例為1:1.25-1.75:1.5-2.5。

3.一種如權利要求1所述細胞色素氧化酶CYP1A1特異性熒光探針的應用，其特征在于：采用該CYP1A1亞酶的特異性底物，與含CYP1A1的生物樣品混合后進行酶促反應，通過定量檢測單位時間內的底物消除率或其去氯乙基化產物的生成率來定量測定不同生物體系中CYP1A1的活性，該應用為非疾病診斷治療目的，具體測定方法及條件如下：

A.體系中以1,8-萘酰亞胺類化合物作為比率型探針底物；底物濃度選擇1/10～10K_m；

B.在PBS緩沖液中，反應溫度為20℃至60℃之間，孵育體系pH介于5.5～10.5之間，

C.反應時間為5～120分鐘，確保以上底物相應的O-去氯乙基化產物達到定量限且底物轉化率不超過20％時終止反應；

D.測定單位時間內底物減少量或O-去氯乙基化產物生成量作為CYP1A1活性的評價指標。

4.按照權利要求3所述的細胞色素氧化酶CYP1A1特異性熒光探針的應用，其特征還在于所述的生物體系為重組表達CYP1A1單酶、哺乳動物的細胞或組織制備物中的任意一種。

5.按照權利要求3所述的細胞色素氧化酶CYP1A1特異性熒光探針的應用，其特征還在于單點測定時底物濃度K_m為1K_m；反應溫度37℃；pH7.4為反應pH值。

6.按照權利要求3所述的細胞色素氧化酶CYP1A1特異性熒光探針的應用，其特征還在于：該探針底物及其去氯乙基化產物的熒光信號需采用不同檢測波長去檢測，特異性底物的熒光檢測條件為：激發波長372nm，最大發射波長452nm；去氯乙基化產物的熒光檢測條件為：激發波長450nm最大發射波長為562nm。

7.一種如權利要求1所述的細胞色素氧化酶CYP1A1特異性熒光探針的應用，其特征在于：該探針底物還可用于CYP1A1抑制劑和誘導劑的快速篩選及抑制和誘導能力的定量評價。

8.一種如權利要求1所述的細胞色素氧化酶CYP1A1特異性熒光底物的應用，其特征在于：該探針底物還可用于活細胞及活組織中CYP1A1功能的實時動態監測，所述應用為非疾病診斷治療目的。