[發(fā)明專利]一種重組PCGUR慢病毒干擾載體、慢病毒、構(gòu)建方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610065907.5
• 申請(qǐng)日: 2016-01-25
• 公開（公告）號(hào): CN105647972A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王煜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/66;C12N7/01;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種重組PCGUR慢病毒干擾載體，其特征在于，將購買的慢病毒干擾 載體PCGUR，經(jīng)內(nèi)切酶AgeI和內(nèi)切酶EcoRI雙酶切后，得到一個(gè)長(zhǎng)序列片段 和一個(gè)短序列片段，然后在所述長(zhǎng)序列片段內(nèi)，連入改造的mmu-miR-199b-5p 基因特異片段，得到重組PCGUR慢病毒干擾載體，所述改造的 mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示， 反義鏈的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組PCGUR慢病毒干擾載體的構(gòu)建方法，其特 征在于，具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟1，獲得改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段

步驟1.1，化學(xué)合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈，其 核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；

化學(xué)合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的反義鏈，其核苷酸序列 如SEQIDNO.4所示；

步驟1.2，將步驟1.1中獲得的正義鏈配置成正義鏈溶液，將步驟1.1中獲 得的反義鏈配置成反義鏈溶液，經(jīng)退火反應(yīng)，獲得改造的mmu-miR-199b-5p基 因特異片段；

步驟2，獲得重組PCGUR慢病毒干擾載體

步驟2.1，購買慢病毒干擾載體PCGUR，并利用內(nèi)切酶AgeI和內(nèi)切酶EcoRI 對(duì)慢病毒干擾載體PCGUR進(jìn)行雙酶切，得到一個(gè)長(zhǎng)序列片段和一個(gè)短序列片 段，然后將長(zhǎng)序列片段進(jìn)行回收，獲得慢病毒干擾載體PCGUR的長(zhǎng)序列片段 產(chǎn)物；

步驟2.2，將步驟1.2中獲得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段和 步驟2.1中獲得的慢病毒干擾載體PCGUR的長(zhǎng)序列片段產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連 接酶連接，獲得連接產(chǎn)物，然后將所述連接產(chǎn)物回收，獲得重組PCGUR慢病 毒干擾載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組PCGUR慢病毒干擾載體的構(gòu)建方法，其特 征在于，所述步驟1中，獲得改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段，具體按 照以下步驟實(shí)施：

步驟1.1a，化學(xué)合成mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈，其核苷酸 序列如SEQIDNO.1所示，并在其5’端添加核苷酸序列ccgg，在3’端添加核苷 酸序列ttttttg，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈；

化學(xué)合成mmu-miR-199b-5p基因特異片段的反義鏈，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，并在其5’端添加核苷酸序列aattcaaaaaa，形成改造的 mmu-miR-199b-5p基因特異片段的反義鏈。