[發明專利]一種抗手足口病人免疫球蛋白及其制備方法

有效

• 申請號: 201610065380.6
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105669860B
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發明（設計）人: 閆磊;于引航;楊莉;孫曉東;孫婷
• 申請（專利權）人: 哈爾濱派斯菲科生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 11485 北京市東方至睿知識產權代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 霍金虎<國際申請>=<國際公布>=<進入

1.一種抗手足口病人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)用中和試驗的方法篩選出手足口病毒不低于1:80中和抗體效價滴度的原料血漿；

(2)以篩選后的所述原料血漿制備混合血漿供試品，所述混合血漿中手足口病毒中和抗體效價滴度不低于1:160；

(3)將所述混合血漿供試品采用低溫乙醇壓濾法分離結合層析法純化生產人免疫球蛋白，生產操作壓力為0.05～0.3MPa，主要包括從血漿中分離組分II+III沉淀、從組分II+III中分離組分II、層析、超濾、病毒滅活、配置、分裝得到產品；

步驟(3)所述免疫球蛋白制備具體步驟包括如下：

(A)從血漿中分離組分II+III：將冷凍血漿在溫度1～4℃之間融化，離心去冷沉淀，用pH值為4.0的醋酸緩沖液調節血漿pH值到6.9～7.3，加入乙醇使血漿中乙醇的最終濃度為8％～10％，使反應液的最終溫度為-1～-4℃，離心分離組分I；調節組分I上清液的pH到5.85～6.05，加入乙醇，使血漿中乙醇的濃度達到20％，使反應液的最終溫度控制在-3.0℃～-5.0℃，用壓濾機進行加壓過濾，過濾后的清液入另一個反應罐，過濾完成時用壓縮空氣將壓濾機吹干，打開壓濾機，收取組分II+III沉淀；

(B)將上步加壓過濾后的組分II+III沉淀加入4～6倍量預冷的注射用水溶解，使反應溫度控制在0～2.0℃；用pH值為4.0的醋酸緩沖液調節制品的pH值為5.05～5.25，加入乙醇使血漿中乙醇的濃度達到18％，反應液溫度最終控制在-4.5℃～-5.5℃，用壓濾機進行加壓過濾分離組分III上清液；向組分III上清液中加入1M碳酸氫鈉溶液調節pH值為7.2～7.6，每升溶液加入2.8g氯化鈉以提高反應液離子強度；加入乙醇使反應液乙醇的最終濃度為25％，在加入乙醇過程中，冷卻反應液，使其最終溫度為-10.0℃～-12.0℃，繼續攪拌0.5小時，靜止1小時后用壓濾機進行加壓過濾，過濾后的清液做回收乙醇處理，過濾完成時用壓縮空氣將壓濾機吹干，打開壓濾機，收取組分II沉淀，組分II沉淀即為手足口病人免疫球蛋白的粗制品；

(C)將上步加壓過濾后的組分II沉淀用0～3℃注射用水溶解5～7小時，溶解溫度控制在0℃～3.0℃；將充分溶解的組分II過濾澄清，調節溶液的pH值至6.50～6.70之間，并調節溶液的電導率為1.30～1.50ms/m；采用陰離子交換層析介質二乙氨乙基交聯葡聚糖凝膠裝填層析柱；用AKTA-process層析系統控制進液流速，將層析柱用pH值為6.5～6.7的0.03M磷酸鹽緩沖液，平衡至出液的pH值為6.5～6.7后上樣，上樣壓力不超過1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上樣結束后，用pH值為6.5～6.7的磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠上的殘余蛋白，合并濾過液和后頂液稱重，用3％鹽酸調節溶液pH至3.50～4.00，將調整好的蛋白液通過轉接管道抽至清潔的反應罐中；

(D)啟動超濾器，開始初濃縮，控制溫度在2℃～10.0℃之間，蛋白濃度達到6％～8％，其單位為g/mL，時，加入2.0℃～10.0℃注射用水,使液蛋白濃度在2％～5％并進行恒體積超濾透析脫鹽,超濾透析過程中蛋白液體積保持恒定；透析過程中保持蛋白液pH在3.50～4.00；透析結束后停止加水，將制品濃縮至蛋白濃度達8％以上，用2.0℃～10.0℃注射用水頂洗超濾系統，將頂洗液合并入超濾罐中；

(E)向超濾濃縮后的蛋白液加入麥芽糖，補加注射用水，調整濃縮后蛋白液的pH值為3.8～4.4，使最終制品中免疫球蛋白含量為50～55g/L，麥芽糖含量為9％～11％，其單位為g/mL，抗體效價不低于1∶800，用0.22um的濾膜除菌過濾，進行低pH孵育法使制品保持在21℃～25℃下21天進行病毒滅活；

(F)在滅菌滅活結束后，通過原液送樣檢測蛋白含量，向藥液中加入注射用水稀釋藥液，再用納米膜過濾法進行病毒去除處理，然后進行除菌分裝即得成品抗手足口病人免疫球蛋白；

所述免疫球蛋白與正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀線為IgG；

步驟(1)所述中和試驗法具體步驟包括如下：

(A)樣品稀釋：血漿樣本用細胞維持液預先進行1：4預稀釋后，56℃滅活30分鐘，后繼續10倍稀釋，即最終1:40倍稀釋的樣品液；打開足夠量的96孔細胞板，標明病毒回滴用板和樣品試驗板，并在各樣品試驗板蓋上標示該板試驗樣本號、病毒型號和代次；在樣品試驗板的各樣品孔中加入25μL細胞維持液,病毒回滴孔與陰性對照孔加入50μL細胞維持液；將預先滅活的樣品液分別加入到96孔細胞板的相應位置，每孔加樣品25μL，每樣品作豎向兩孔平行；所述細胞維持液為體積比為3％的胎牛血清的DMEM液；

(B)攻擊病毒：攻擊病毒液制備：根據試驗的標本數用維持液制備足量的攻擊病毒液，將病毒稀釋到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔與陰性對照孔外，其余各孔中均加入50μL含100CCID50的攻擊病毒液；回滴100CCID50攻擊病毒液：用細胞維持液將攻擊病毒液作10^-1、10^-2、10^-3稀釋，將攻擊病毒液10⁰與其10^-1、10^-2、10^-3稀釋度的病毒液分別加入到相應的病毒回滴用96孔細胞板孔中，每個稀釋度加10孔，50μL/孔；陰性對照：向陰性對照各孔中再加入50μL細胞維持液；將所有96孔細胞板放入37℃、含有CO₂體積百分數為5％的培養箱中和培養2小時；

(C)細胞懸液的配制與添加：細胞懸液的配制：取足夠量的RD細胞，即人橫紋肌瘤細胞，消化后計數，稀釋至試驗所需的細胞液量，試驗用細胞懸液濃應為1×10⁵個/mL，配好的細胞液立即使用；細胞懸加：中和培養后每孔加細胞懸液100μL，1×10⁴個/孔；

(D)培養及觀察統計：將完成以上操作的96孔細胞板放置37℃、含有CO₂體積百分數為5％的培養箱中培養7天，病毒接種后的第5天顯微鏡下觀察細胞生長情況，第7天最終判定結果，并記錄統計。