[發明專利]犀牛源性成分的PCR檢測引物及檢測方法

有效

• 申請號: 201610065065.3
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105525017B
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 趙福振;羅寶正;薄清如;邵建宏;廖秀云;沙才華;陳軒;黃海超
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚志強

本發明公開了一種脊椎動物源性成分的通用PCR檢測引物及檢測方法。所述引物的序列為：F?primer：5’?TGTTTACCAAAAACATCACCTCCA?3’；R?primer：5’?AGTTAAAGCTCCATAGGGTCT?3’。本發明根據GenBank中公布的多種脊椎動物線粒體DNA（mtDNA）序列，在其高度保守區域設計了一對通用型引物并建立通用PCR檢測方法，實驗結果表明該引物通用性強，實現了對所有收集到樣品的有效擴增，結合測序結果實現了對物種的有效鑒定。

技術領域

本發明屬于分子檢測技術領域，具體涉及一種犀牛源性成分的PCR檢測引物及檢測方法。

背景技術

在生物學史上，犀牛曾遍布全球，其物種將近30個屬，據史冊記載，我國南部地區曾有大獨角犀的分布。兩千多年來，犀牛被全人類視為珍稀藥用動物，尤其是犀牛角，我國中醫研究認為其具有解熱、涼血、解痙、解毒、定驚等奇效，外國認為其具有壯陽的效果，阿拉伯地區將犀牛角用于制作成名貴的阿拉伯彎刀刀柄，中國古代也將犀牛皮用于制作士兵鎧甲。由于帝制時期對犀牛的過渡獵殺，1922年犀牛在我國已沒有分布，因此犀牛未被列入《中國動物分類代碼》和《中國國家重點保護野生動物名錄》。但根據國際上的物種分類研究，犀牛歸類于哺乳綱奇蹄目角型亞目犀科，現存犀牛包括白犀、黑犀、印度犀、爪哇犀和蘇門答臘犀五個物種，均被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄。1993年國務院發布的第39號文件也明確禁止了犀牛角(包括其任何可辨認部分和含其成份的藥品、工藝品等)在我國的進出境、貿易、郵寄、攜帶、制藥等行為。由于犀牛的珍稀和犀牛角的藥用價值，在巨大利益的驅使下，獵殺犀牛、販賣犀牛角等非法行徑在全球范圍內并不鮮見，印度犀(現存體型最大的犀牛物種)的角在黑市貿易中甚至以每千克250萬元人民幣的價格出售。

現階段國際上對于犀牛的研究主要集中在物種保護和疾病診治上，同時由于犀科物種的瀕危，國際動物保護組織也已禁止犀牛角的交易，因而世界各國對于檢測和鑒定犀牛源性成分的研究非常有限。為進一步加強對現存犀科物種的保護，提高對非法販賣犀牛角及其制品的打擊力度，提升鑒定真假犀牛角及其制品的效率和準確性，建立一種更加合適的對來源于犀牛的可疑樣品的分子生物學檢測方法是十分必要的。

目前對犀牛源性成分DNA檢測方面幾乎空白，對最重要的犀牛角及其制品的鑒定也只局限于形態觀察法、顯微鏡觀察比對法、紫外燈熒光分析法、細胞色素b基因檢測法、紅外光譜分析法和高效液相色譜法。上述各種方法都存在或主觀、或片面、或準確率不高、或應用面不廣等弊端。尚無用于鑒定犀牛源性成分的分子生物學檢測方法。

發明內容

針對現有技術中所存在的不足，本發明的目的在于提供一種犀牛源性成分的PCR檢測引物及檢測方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種犀牛源性成分的PCR檢測引物對，是根據犀牛線粒體DNA序列的保守區域設計的。其核苷酸序列如下所示：

F：5’-CATCCATAGCCATYATAGCCCT-3’(SEQ ID NO.1)，

R：5’-CACCAATCTAGGGAGGGT-3’(SEQ ID NO.2)。

一種犀牛源性成分的PCR檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取樣品DNA作為擴增模板，犀牛源性DNA樣品作為陽性對照；

(2)以上述引物對進行PCR擴增；

(3)對PCR產品進行凝膠電泳，根據電泳結果判斷樣品中是否含有犀牛源性成分。

25μL PCR反應體系的組成為：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，10μmol/L上下游引物各1.0μL，DNA模版2.0μL，補水至25μL。