[發(fā)明專利]一種用于全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610064387.6
• 申請日: 2016-01-30
• 公開（公告）號: CN105543163A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬桂蘭;喬自林
• 申請（專利權(quán)）人: 馬忠仁;馬桂蘭;喬自林
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 呂玉博

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的無血清 培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

流感(禽流感)是危害人類健康和養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病，疫苗接種是目前預(yù)防 流感(禽流感)的最主要手段之一，傳統(tǒng)流感疫苗用雞胚培養(yǎng)生產(chǎn)，該方法存在制備過程中 微生物污染幾率高、產(chǎn)品內(nèi)毒含量高、注射副反應(yīng)大、廢物有環(huán)境污染處理成本高、流感大 流行暴發(fā)時雞胚供應(yīng)困難和生產(chǎn)周期長等工藝缺點，因此開發(fā)安全、高效的動物細(xì)胞基質(zhì) 流感疫苗勢在必行。

MDCK細(xì)胞(Madin-Darbycaninekidneycells，MDCK)由Madin和Darby于1958年 從美國CockerSpaniel母曲架犬的腎臟組織分離培養(yǎng)。是目前公認(rèn)的適于甲、乙型流感病 毒疫苗生產(chǎn)的理想細(xì)胞系之一，已有荷蘭蘇威制藥公司、瑞士諾華公司和美國阿斯利康旗 下的MedImmune公司批準(zhǔn)利用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗。我國也有多家企業(yè)正在利用MDCK細(xì) 胞進行流感疫苗的研發(fā)，但目前還沒有自主研發(fā)的MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗上市，原因除 我國企業(yè)起步較晚外，MDCK細(xì)胞培養(yǎng)個性化培養(yǎng)基也是制約我國細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗研發(fā)進 程的重要因素。

我國許多細(xì)胞基質(zhì)的疫苗正在進行或完成了從傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝向生物反應(yīng)器高 密度培養(yǎng)工藝升級轉(zhuǎn)型，生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞有兩種方式，一種是利用細(xì)胞本身要貼附在 培養(yǎng)物表面生長的特性進行微載體培養(yǎng)，這種方式要實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)時工藝路線復(fù)雜不容 易掌握，導(dǎo)致的結(jié)果是現(xiàn)有條件下培養(yǎng)規(guī)模小，在生產(chǎn)中要使用數(shù)量很多的小型生物反應(yīng) 器才能生產(chǎn)任務(wù)，由于反應(yīng)器之間的差異最終導(dǎo)致整個產(chǎn)品有較大的批間差，而且培養(yǎng)工 藝中要使用動物血清提供細(xì)胞在微載體上貼附的貼壁因子，增加了生物安全的風(fēng)險和下游 純化工藝。第二種將細(xì)胞馴化成可全懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞后進行生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)，目前 用BHK21細(xì)胞在口蹄疫疫苗中已全部完成工藝升級，國內(nèi)生物反應(yīng)器無血清培養(yǎng)的單罐培 養(yǎng)體積可達3000L，是微載體培養(yǎng)單罐體積的60倍之多。全懸浮培養(yǎng)工藝容易線性放大，而 且還可采用無血清培養(yǎng)基，提高了下游產(chǎn)品的生物安全性，簡化了純化工作，是目前新疫苗 研發(fā)的方向。

無血清培養(yǎng)基使用成分明確的血清替代物，不僅簡化了下游工藝，也避免了生物 污染風(fēng)險，但是目前血清成分仍不清楚，況且MDCK細(xì)胞本身對培養(yǎng)條件要求高，開發(fā)該細(xì)胞 無血清培養(yǎng)基一直是該領(lǐng)域研究的重點和難點。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的 無血清培養(yǎng)基，為我國流感疫苗生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝提供支撐。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，所述 培養(yǎng)基由含NaCl為5g/L的DMEM/F12培養(yǎng)基和以下組分組成：亞錫酸鈉；重組人表皮細(xì)胞生 長因子(EGF)；氫化可的松；重組全鏈胰島素；前列腺素(E1)；人轉(zhuǎn)鐵蛋白；甲狀腺素(T3)；維 生素E；膽固醇；乙醇胺；β-巰基乙醇；吐溫-80；HyPep1510；重組人血白蛋白ACF；甘露醇糖。

作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基由含NaCl為5g/L的DMEM/F12培養(yǎng)基和以下組分組成：

微量元素：

亞錫酸鈉0.000001-0.00001g/L

生長因子：

重組人表皮細(xì)胞生長因子(EGF)0.00005-0.0005g/L

氫化可的松0.000012-0.00006g/L

重組全鏈胰島素0.001-0.01g/L

前列腺素(E1)0.00001-0.00005g/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白0.002-0.008g/L

甲狀腺素(T3)1-5×10^-10g/L

脂類復(fù)合物：

維生素E0.00001-0.0001g/L

膽固醇0.00001-0.0001g/L

乙醇胺0.0005-0.001g/L

β-巰基乙醇0.0005-0.001g/L

吐溫-800.005-0.01g/L

植物水解物：

HyPep15101-10g/L

重組人血白蛋白：

ACF0.5-5g/L

其它：

甘露醇糖0.5-5g/L。