[發明專利]一種應用于矮馬遺傳多樣性檢測的微衛星標記方法

在審

• 申請號: 201610063075.3
• 申請日: 2016-01-30
• 公開（公告）號: CN105483270A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: 楊勝林
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李余江;程新敏

技術領域

本發明屬于動物分子遺傳學技術領域,具體涉及矮馬的微衛星DNA標記技術。

背景技術

微衛星是近十幾年來發展起來的一種新的分子標記，它是指以少數幾個核苷酸(1 ~6個)為單位多次重復的簡單序列，其中以雙核苷酸重復最為常見。應用于相關種群的遺 傳多樣性檢測和遺傳圖譜的構建。目前微衛星序列的獲得主要有兩種途徑：一種是用經典 的分子生物學方法構建富含有微衛星位點的基因組文庫，通過雜交篩選出含有微衛星序列 的陽性克隆，但是篩選過程較復雜，篩選效率低，需要大量的人力和資金的投入；另一種是 從已知的核酸序列中進行檢索，但是可檢索的資源相對有限。中國矮馬是我國的珍稀瀕危 物種，對其遺傳多樣性的評價具有重要意義。目前，涉及矮馬的微衛星分離制備方法還十分 少見。因此，尋求新的矮馬微衛星分離方法十分重要。

目前本領域技術人員能夠獲知的比較相近的已公開技術主要有如下這些：

1、申請號號為01106477.3，名稱為適用于豬品種分類的豬微衛星DNA標記的公開中國 發明專利文獻，該發明的特征是,構建部分小插入片段基因組文庫,分離鑒定豬新微衛星標 記,篩選其中適用于豬品種分類的豬微衛星標記HAU01、HAU02、HAU03,確定了該三個微衛星 標記DNA順序,設計了三個位點的引物。該發明為豬的品種分類、親緣鑒定和標記輔助育種 提供新的分子標記。

2、申請號為201410022080.0，名稱為草魚親子鑒定微衛星熒光多重PCR的方法的 中國公開專利文獻，該發明利用微衛星標記與多重熒光PCR技術結合，篩選了13個高度多態 性微衛星位點，組建3個多重熒光PCR體系，通過測序儀分型，對草魚家系進行高通量個體識 別和親子關系分析；本發明的建立為草魚種質鑒定、家系管理和增殖放流效果評估提供了 一種新的技術手段。

以上這些這些技術的缺點是：應用多種內切酶共同切割基因組DNA的方法。此方法 可以產生比較理想的片段，得到足夠的側翼序列來設計引物，但是如果用多酶切會產生不 是平端的酶切產物，產物需要進行末端補平。

發明內容

本發明擬通過構建微衛星DNA文庫、微衛星序列篩選、引物設計與優化和微衛星 檢測等步驟來實現來獲得可靠的微衛星標記序列，為中國矮馬的遺傳多樣性檢測提供分子 標記手段。

本發明是這樣實現的：

一種應用于矮馬遺傳多樣性檢測的微衛星標記方法，該方法包括如下步驟：

步驟1：矮馬基因組PCR文庫創建；

步驟2：磁珠法進行微衛星序列篩選；

步驟3：矮馬微衛星標記序列分類與驗證。

其中，步驟1中矮馬基因組PCR文庫創建包括如下步驟：

步驟1.1：矮馬基因組DNA的提取；

步驟1.2：超聲波破碎基因組DNA；

步驟1.3：根據目的片段的大小調整樣本處理儀參數；

步驟1.4：超聲波破碎后的DNA電泳檢測；

步驟1.5：創建基因組PCR文庫。

步驟1.5中，用獲得的DNA片段作為模板，設計引物（5'-GATCGTCGACGG TACCGAATTCT；5'-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC），進行 PCR擴增，創建基因組PCR文庫。

步驟2中磁珠法進行微衛星序列篩選包括如下步驟：

步驟2.1：用生物素標記的微衛星探針和Dynal磁珠與微衛星文庫雜交；

步驟2.2：磁珠的平衡；

步驟2.3：磁珠吸附富集；

步驟2.4：捕獲含有微衛星序列的單鏈DNA并進行PCR擴增；

步驟2.5：連接T-載體，克隆；

步驟2.6：原位雜交，用同位素探針進行二次篩選。

步驟2.1采用以下方法實現：根據實驗材料建立50μL反應體系,1.5μL生物素標記 的(CA)15探針、5μL(50μmol/L)引物、15μL20×SSC、0.5μL10%SDS和16μLddH2O，混合，68 ℃預熱；將12μL(276ng)DNA95℃變性5min，加入預熱的雜交混合液，68℃雜交1h；雜交過程 中平衡磁珠。