[發(fā)明專利]一種石斛超低溫保存脫毒的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610062743.0
• 申請(qǐng)日: 2016-01-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105706922B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹樺;李涵;李紳崇;聞?dòng)阑?/a>;趙培飛;楊維;李慧敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所;云南集創(chuàng)園藝科技有限公司
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司53100
• 代理人: 徐玲菊,于洪

1.一種石斛超低溫保存脫毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），選擇1月苗齡的帶有CyMV和ORSV病毒的石斛組培苗，取石斛組培苗帶有單芽的莖段1.0-1.5cm，接種到基本培養(yǎng)基上，在4℃黑暗條件下煉苗3-5周；所述1月苗齡是繼代培養(yǎng)1月的石斛組培苗，苗高度為2-3cm；

所述基本培養(yǎng)基為：1/2MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8；

步驟（2），從步驟（1）所煉的苗上剝?nèi)?-3mm長(zhǎng)的莖尖，然后將莖尖在4℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)1-3d；接著在超凈工作臺(tái)上，采用高糖加載液對(duì)莖尖加載20-40min后，將莖尖轉(zhuǎn)移到玻璃化溶液PVS2中脫水30-60min，再將莖尖投入液氮中保存30min-1h，之后將莖尖在室溫下迅速轉(zhuǎn)入卸載液中解凍并卸載20-30min，或是將莖尖在37℃水浴中解凍3-4min再轉(zhuǎn)入卸載液中卸載20-30min，卸載后的莖尖接種到成活培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)1-3d，后轉(zhuǎn)入正常光照下繼續(xù)培養(yǎng)，獲得石斛脫毒苗；

所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：1/2MS+0.3-0.6mol/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8；

所述加載和脫水過(guò)程都在冰上進(jìn)行；

所述高糖加載液為：1/2MS+2mol/L甘油+0.3-0.7mol/L蔗糖，pH5.8；

所述玻璃化溶液PVS2為：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMSO，pH5.8；

所述卸載液為：1/2MS+1.2mol/L蔗糖，pH5.8；

所述成活培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1-0.2ml/L NAA+0.1-2.0ml/L 6-BA+50g/L馬鈴薯+25g/L香蕉+7g/L瓊脂，pH5.8；

所述正常光照培養(yǎng)是在溫度25±1℃、光照強(qiáng)度1000-2000lx、光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石斛超低溫保存脫毒的方法，其特征在于，步驟（2）中在體視顯微鏡下剝?nèi)?-3mm長(zhǎng)的莖尖。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石斛超低溫保存脫毒的方法，其特征在于，將莖尖投入液氮中保存時(shí)采用小滴玻璃化法或玻璃化法。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的石斛超低溫保存脫毒的方法，其特征在于，所述的小滴玻璃化法是將鋁箔紙剪成（0.8-1）cm×（2-2.2）cm長(zhǎng)條形的鋁箔條，將經(jīng)PVS2脫水處理后的莖尖放到鋁箔條光滑的一面上，向莖尖上滴加PVS2，使莖尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后將鋁箔條直接浸入液氮中進(jìn)行冷凍，冷凍后將鋁箔條裝入凍存管中，擰緊蓋子，最后投入液氮中保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的石斛超低溫保存脫毒的方法，其特征在于，所述的玻璃化法是將經(jīng)PVS2脫水處理后的莖尖放入冷凍管中，向冷凍管加入PVS2使莖尖浸泡在PVS2中，蓋緊蓋子后直接將冷凍管投入液氮中保存。