[發明專利]一種洛伐他汀酰基轉移酶突變體

在審

• 申請號: 201610062451.7
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105586325A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 唐圓圓;許琨;李韻;郭紅霞
• 申請（專利權）人: 重慶西南合成制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/06
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅;李金蓉

技術領域

本發明涉及藥物合成領域，具體涉及辛伐他汀的合成及合成用酶，更具體的，涉及 較野生型酰基轉移酶具有活性增強、產物耐受性提高的，非天然存在的酰基轉移酶突變體、 編碼所述酰基轉移酶突變體的多核苷酸、包含此類多核苷酸的宿主細胞、所述酰基轉移酶 的生產方法及使用本發明所述酰基轉移酶突變體生物催化合成辛伐他汀的方法。

背景技術

辛伐他汀(simvastatin)是Merck公司研制的降血脂藥，商品名Zocor，是洛伐他汀 的半合成衍生物，而洛伐他汀則由土曲霉(Aspergillusterreus)發酵液中分離得到。辛伐 他汀的藥理作用是作為競爭性抑制劑抑制肝臟細胞內羥甲戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase)活性，限制HMG-CoA向甲基二羥戊酸的轉化，從而減少內源總膽固醇生物合成的 總量。與等劑量的洛伐他汀(lovastatin)相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的總膽 固醇和低密度脂蛋白膽固醇。

目前生產辛伐他汀使用的主流工藝路線由Sleiteinger提出，后經Verhoeven、 Kumar等修改提高。該路線以洛伐他汀為起始物，經歷有機胺開環、雙羥基保護、甲基化、脫 保護、成銨鹽、環合等工藝步驟，得到辛伐他汀：

但是，這一路線存在試劑毒性大，反應條件苛刻，副反應多，產品分離純化難度大等問 題，導致目前辛伐他汀的生產成本高、污染大。因此，急需一種毒性低、效率高、污染少的生 產方法。近年來，隨著綠色化學概念的提出和對環境保護的日益重視，生物催化高效低毒低 污染的特點引起了人們的興趣，并將注意力轉向該領域。

WO1994026920公布了一種利用脂酶和脂肪酶作為催化劑合成辛伐他汀的方法，由 于需要進行區域選擇性酯化，仍必須對其它羥基進行保護，導致產品收率降低。 WO2005040107所公布的方法也存在同樣的問題，效率仍未有明顯提高。

US2009191602(A1)報道了土曲霉的洛伐他汀生物合成基因簇，該基因簇編碼一個 46KDa的蛋白質（SEQIDNo.1），即洛伐他汀酰基轉移酶（LovD），可將酰基硫酯的酰基基團 區域選擇性酰基化莫納可林J酸C8羥基，為生物合成辛伐他汀的有效酶制劑：

雖然目前已經分離純化并克隆表達出天然存在的LovD，但是野生型的LovD還存在很多 問題，如酶活性較低，產物抑制等，導致難以實現工業化應用。US2010052038、 US2010050253、CN201310315499.0、CN201310345811.0等對此進行研究，得到了活性提高的 酰基轉移酶突變體。然而不可忽視的是，上述突變體在高濃度條件下仍然存在產物/副產物 抑制現象，盡管采取一些措施，如使用沉淀劑使酶催化產物析出沉淀，添加活性炭等吸附劑 吸附反應副產物硫醇，緩解產物/副產物對酶的抑制，促使反應向產物方向移動，但是上述 方法仍不能徹底解決產物/副產物抑制問題，導致反應轉化率通常在95%左右，降低了原料 利用率的同時，給下游分離純化帶來不便。因此，利用分子生物學手段對酰基轉移酶進行改 造，在提高酶活性的同時，增強酶對產物/副產物的耐受性，解除產物抑制，是促進酰基轉移 酶生產辛伐他汀產業化的有效途徑。

發明內容

本發明克服現有技術的不足，提供一種新的洛伐他汀酰基轉移酶（LovD）突變體， 編碼該突變體的基因，以及該突變體在制備辛伐他汀中的用途。

本發明采用的技術方案是，一種洛伐他汀酰基轉移酶突變體包括以下處理：在氨 基酸序列為SEQIDNO.1的野生型酰基轉移酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1個或多 個氨基酸，或者/以及在氨基酸序列為SEQIDNO.1的野生型酰基轉移酶的氨基酸序列的一 個或兩個末端添加或刪除1個或多個氨基酸。與使用野生型酰基轉移酶相比，其酰基轉移 酶活性增強2-100倍。