[發明專利]腸黏膜腦源性神經營養因子BDNF標本的染色化學檢測方法

有效

• 申請號: 201610061896.3
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105699155B
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發明（設計）人: 辛學知
• 申請（專利權）人: 山東省千佛山醫院;辛學知
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N33/53
• 代理公司: 濟南信達專利事務所有限公司 37100
• 代理人: 姜明

1.腸黏膜腦源性神經營養因子BDNF標本的染色化學檢測方法，其特征在于該方法包括：

（一）標本染色步驟：

（1）脫蠟與水化：腸黏膜腦源性神經營養因子BDNF標本干燥后的切片用二甲苯脫蠟，再逐級經純酒精及梯度酒精直至蒸餾水；

（2）蘇木精液染色60s；

（3）流水洗去蘇木精液10s；

（4）1%鹽酸乙醇洗3s ；

（5）水洗2s；

（6）促藍液返藍洗10s；

（7）流水沖洗30s；

（8）伊紅染色60s；

（9）蒸餾水洗2s；

（10）80%乙醇洗2s；

（11）95%乙醇洗2s；

（12）無水乙醇洗2s；

（13）石炭酸二甲苯洗3s；

（14）二甲苯洗3s；

（15）二甲苯洗3s；

（16）中性樹膠封固，封片時每片載玻片滴加1～2滴明膠，將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現氣泡；

（二）標本染色后化學法檢測步驟：

a.石蠟切片脫臘及水化

a1.脫蠟：將染色后切片放入染色筐中，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各放置15min進行完全脫臘；

a2.水化：切片放入100%酒精Ⅰ、Ⅱ中各10min后，于95%酒精水化5min→90% 酒精水化5min→80%酒精水化5min→70%酒精水化5min→蒸餾水浸洗10min；

b.抗原修復:將a步驟切片插入250 ml、濃度為0.01mol/L、pH值為6.0的檸檬酸鈉抗原修復液中，用微波高檔加溫緩沖至96℃15 min，注意避免煮沸，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗；

c.清除內源性過氧化物酶活性：用0.3% H₂O₂甲醇溶液孵育20分鐘，放入60%酒精5min，放入蒸餾水5min，PBS緩沖液洗5min；

d.封閉：用于二抗來源動物相同的正常山羊血清封閉60分鐘；

e.一抗孵育：加入兔抗人PDG9.5抗體，300倍稀釋，陰性對照滴加PBS，4℃孵育過夜；

f.二抗孵育：加二抗前用PBS對切片漂洗三次，每次5min，把未結合的一抗完全洗掉；加入生物素標記的山羊抗兔IgG二抗，二抗按1:2000稀釋，室溫孵育30分鐘，后用PBS洗滌5min×3次；

g.加入辣根酶標記鏈霉卵白素液，孵育30分鐘；PBS洗滌洗5min×3次；

h.DAB顯色：先以少量PBS或Tris-HCl緩沖液溶解DAB，然后再加入余量緩沖液，在顯色前加入30% H₂O₂，將洗滌后的切片浸入顯色液中5-10-20min，閉光下反應，并隨時在顯微鏡下觀察結果，陽性反應部分為棕色時終止反應，在自來水洗滌切片10min；

i.細胞核復染：將切片放入蘇木素中做核復染20s～1min，經酒精-HCl分化后，放入自來水中繼續分化細胞核；

j.封片：經70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100% Ⅱ酒精脫水各2min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ分別透明5min后，用樹膠封片。