[發(fā)明專利]一種保存叢枝菌根真菌的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610061105.7
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105532411A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫錦;張杰;郭世榮;束勝;王磊;吳亞勝
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01G31/00
• 分類號: A01G31/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及到一種保存叢枝菌根真菌的方法。

背景技術(shù)

叢枝菌根真菌(arbuscularmycorrhizafungi,AMF)是一類能與絕大部分植物的根系形 成互惠共生體的微生物，它在地球上存在了4.6億年之久，廣泛的分布在農(nóng)田、森林、草地、 荒漠等各種生態(tài)系統(tǒng)中。叢枝菌根真菌資源豐富，從地球南極到北極都有分布；宿主多樣性豐 富，全世界有380科30萬種高等植物均能與其形成叢枝菌根。AMF的應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，在農(nóng)林 業(yè)生產(chǎn)中具有重要的意義。迄今為止，AMF尚不能完全在離體條件下純培養(yǎng)，其保存方法主要 有：①盆栽培養(yǎng)法(Potculture)，一般采用沙、土壤等的混合基質(zhì)，高梁和白三葉草為宿主 植物。是一種最為可靠與廣泛的叢枝菌根真菌的保存方法；②培養(yǎng)基培養(yǎng)法(Mediumculture)， 是將宿主植物和AMF抱子在無菌培養(yǎng)基上共培養(yǎng)的方法，克服了土壤因素對培養(yǎng)的影響，可得 到純度較高的無雜菌菌劑。但培養(yǎng)基成分要求嚴(yán)格，較難達(dá)到高侵染水平，無法完成大規(guī)模保 存AMF的目的；③靜止?fàn)I養(yǎng)液培養(yǎng)法(Restinghydroponicculture)，利用白三葉草在滅菌的 營養(yǎng)液中培養(yǎng)AMF。這種方法所需裝置成本較高，實際應(yīng)用中局限性較大。；④營養(yǎng)流動液培 養(yǎng)法(Nutritionflowculture)，這種方法盡管沒有了土壤微生物的污染，但由于根系長期 浸泡在液體中，不利于根系和真菌的呼吸，對菌劑的繁殖速度和質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響；⑤汽 霧培養(yǎng)法(Aeroponicculture)，可在無土條件下大量生產(chǎn)AMF菌劑，生產(chǎn)的菌劑質(zhì)量較高，但 霧化培養(yǎng)系統(tǒng)需要特制的噴霧培養(yǎng)裝置，對參數(shù)要求嚴(yán)格的營養(yǎng)液，技術(shù)要求高，操作復(fù)雜， 成本較高，產(chǎn)量相對較少；⑥玻璃珠分室培養(yǎng)法(Glassbeadssplit-compartment culture)，此法得到的菌劑較為純凈，真菌和基質(zhì)易于分離，培養(yǎng)出大量保持自然菌落的AMF， 但培養(yǎng)過程中養(yǎng)分等培養(yǎng)條件需要嚴(yán)格控制，操作繁瑣，技術(shù)要求高；⑦大田培養(yǎng)法(Field culture)，這是生產(chǎn)上大面積生產(chǎn)菌劑的方法，可以大大降低成本，便于大面積推廣應(yīng)用， 但AMF仍然受多種因素的影響；⑧AMF與植物離體根器官的無菌雙重培養(yǎng)法(Dualaxenic cultureofAMFwithRiT-DNAtransformedroot)，AMF孢子在無菌的無機(jī)礦質(zhì)營養(yǎng)培養(yǎng)基 中與離體根建立共生體，即雙重培養(yǎng)。此法排除了外界微生物的干擾，且不需要植物地上部分， 避免外因的影響。但操作復(fù)雜，制備工藝繁瑣，不適于叢枝菌根真菌的大規(guī)模保存；⑨AMF 與RiT-DNA轉(zhuǎn)型根的雙重單胞無菌培養(yǎng)法(DualmonoaxeniccultureofAMFwithRiT-DNA transformedroot)，這種方法避免了人為環(huán)境條件的干擾，不破壞菌根菌絲生長可原位觀察 到它的形態(tài)發(fā)育及其生理生化特性。但這種方法同樣面臨著操作復(fù)雜，制備工藝繁瑣的問題， 并不適用于AMF的大規(guī)模保存。

對比這些叢枝菌根真菌的培養(yǎng)保存方法，活體宿主植物盆栽培養(yǎng)法是最簡單、最容易、也 是最可靠的AMF保存方法。傳統(tǒng)的活體宿主植物盆栽培養(yǎng)法保存叢枝菌根真菌是把植物和叢枝 菌根同時接入到土壤或者沙土基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。采用這種方法保存叢枝菌根真菌的過程中，為 保證菌種的單一純凈，在接種菌種前都要對于栽培基質(zhì)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，殺死基質(zhì)中含有的 雜菌。土壤一經(jīng)滅菌，不但破壞了土壤中原本微生物賴以生存的生存環(huán)境，而且削弱了土壤肥 力；相較于有機(jī)基質(zhì)栽培，寄主植物生長緩慢，導(dǎo)致與叢枝菌根真菌的共生發(fā)生時間較長；另 外，土壤因地區(qū)不同而差異較大，且內(nèi)部環(huán)境復(fù)雜，影響叢枝菌根真菌的生長及活性；而且， 天然土壤笨重，完成以土壤為基質(zhì)的盆栽培養(yǎng)，需要大量重體力勞動。此外，該方法制備流程 繁瑣，且易造成生態(tài)破壞，并不適于商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

選用沙、土壤等的混合基質(zhì)，以根系數(shù)量大的多年生草本植物或一年生植物做寄主植物培 養(yǎng)叢枝菌根真菌的報道較多，然而利用泥炭、椰糠、蛭石、珍珠巖等有機(jī)物混配作為培養(yǎng)基質(zhì)， 以生長速度快的番茄作為寄主植物，采用穴盤育苗的方法保存叢枝菌根真菌的保存的方法尚未 見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對上述領(lǐng)域的空白，提供一種保存叢枝菌根真菌的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：