[發(fā)明專利]一種非診斷目的的血液微生物耐藥性基因的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610061034.0
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號(hào): CN105603080B
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡長峰;彭海
• 申請（專利權(quán)）人: 江漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 11138 北京三高永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 徐立

1.一種非診斷目的的血液微生物耐藥性基因的檢測方法，其特征在于，所述方法包括：

確定待測樣品中需要檢測的微生物的耐藥性基因、所述待測樣品中的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和所述待測樣品的外源標(biāo)準(zhǔn)基因，所述待測樣品為血液；

制備用于擴(kuò)增所述耐藥性基因、所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測試區(qū)域的多重?cái)U(kuò)增引物；

向所述待測樣品中加入所述多重?cái)U(kuò)增引物不能擴(kuò)增的外源核酸，提取所述待測樣品的基因組，將所述外源核酸與所述待測樣品的基因組一同提取；

向所述待測樣品的基因組中加入所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因，獲得混合核酸；

利用所述多重?cái)U(kuò)增引物對所述混合核酸進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，利用所述擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建高通量測序文庫；

對所述高通量測序文庫進(jìn)行高通量測序，得到測序片段組；

分析所述測序片段組，獲得所述待測樣品中所述耐藥性基因的測序片段的數(shù)量、所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的質(zhì)量與所述混合樣品的基因組的總質(zhì)量的比例大于1/100000；

根據(jù)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量和所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量，判斷實(shí)驗(yàn)是否成功，所述判斷實(shí)驗(yàn)是否成功的方法為：當(dāng)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量和所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量均≥α1時(shí)，則實(shí)驗(yàn)成功；當(dāng)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量或所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量<α1時(shí)，則實(shí)驗(yàn)失敗；其中，α1為判定閾值；

若所述實(shí)驗(yàn)成功，則計(jì)算所述待測樣品中所述耐藥性基因的含量，計(jì)算所述待測樣品中所述耐藥性基因的含量的方法為：第m種所述耐藥性基因的含量的計(jì)算公式為其中，i為第m種所述耐藥性基因的第i個(gè)測試區(qū)域，n1為所述第m種所述耐藥性基因的測試區(qū)域的個(gè)數(shù)，bi為所述第m種耐藥性基因的第i個(gè)測試區(qū)域的測序片段的數(shù)量，k為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因，n3為所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的個(gè)數(shù)，j為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的第j個(gè)測試區(qū)域，n2為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測試區(qū)域的個(gè)數(shù)，aj為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的第j種測試區(qū)域的測序片段的數(shù)量；N為所有所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測試區(qū)域的總數(shù)；

根據(jù)所述耐藥性基因的含量判定所述待測樣品是否含有耐藥性基因，判定所述待測樣品中是否含有所述耐藥性基因的方法為：所述耐藥性基因的含量≥α2時(shí)，判定所述待測樣品含有所述耐藥性基因；當(dāng)所有所述耐藥性基因的含量<α2時(shí)，判定所述待測樣品不含有所述耐藥性基因；其中，α2為判定閾值。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述耐藥性基因至少為1個(gè)，所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因至少為1個(gè)，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因至少為1個(gè)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)樗龃郎y樣品的微生物中的基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因不存在于已知基因組的生物中。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，用于擴(kuò)增所述耐藥性基因的引物的設(shè)計(jì)區(qū)域或擴(kuò)增區(qū)域與所述待測樣品中的生物的基因組的其它區(qū)域的同源性低于98％。