[發(fā)明專利]一種小麥微生物定性與定量的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610060949.X
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105603075A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張靜;胡長峰;彭海
• 申請（專利權(quán)）人: 江漢大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04;C12Q1/70
• 代理公司: 北京三高永信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11138
• 代理人: 徐立

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種小麥微生物定性與定量的檢測方法。

背景技術(shù)

小麥微生物是小麥病害鑒定與預(yù)報，小麥?zhǔn)称钒踩闹匾罁?jù)，小麥微生物精確 地定性與定量檢測是十分必要的。

現(xiàn)有小麥微生物定性與定量檢測技術(shù)包括形態(tài)學(xué)計數(shù)、芯片檢測、16SrRNA測序、 宏基因組測序和實時定量PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。形態(tài)學(xué)計 數(shù)檢測需要對微生物進行預(yù)培養(yǎng)，耗時長，不可培養(yǎng)微生物不可檢測，一次僅能夠檢測一種 微生物，通量低，在計數(shù)時抽樣量有限，且結(jié)果粗糙，無法對種以下的分類單元進行區(qū)分。芯 片檢測所需的待測樣品的DNA量大，需要對微生物進行預(yù)培養(yǎng)及富集處理，檢測結(jié)果不準(zhǔn) 確，且無法做定量檢測。16SrRNA測序無法對種以下的分類單元進行區(qū)分。宏基因組測序深 度有限，對于低含量的微生物的定量檢測準(zhǔn)確度很差。實時定量PCR一次只能檢測一種微生 物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，無法計算微生物定性與定量的可靠性，使得結(jié)論實 用性差。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中微生物定性與定量檢測不準(zhǔn)確的問題，本發(fā)明實施例提供了 一種小麥微生物定性與定量的檢測方法。所述技術(shù)方案如下：

本發(fā)明實施例提供了一種小麥微生物定性與定量的檢測方法，所述方法包括：

確定待測樣品中的目標(biāo)微生物類群、目標(biāo)微生物和非目標(biāo)生物、以及不存在于所 述待測樣品中的參考微生物，所述待測樣品為小麥；

根據(jù)所述目標(biāo)微生物類群、所述目標(biāo)微生物、所述參考微生物和所述非目標(biāo)生物 的參考基因組序列，獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域、所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域和 所述參考微生物的特征區(qū)域；

制備擴增所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的第一多重擴增引物、擴增所述目標(biāo)微 生物的特征區(qū)域的第二多重擴增引物和擴增所述參考微生物的特征區(qū)域的第三多重擴增 引物，將所述第一多重擴增引物、所述第二多重擴增引物和所述第三多重擴增引物混合得 到混合多重擴增引物；

向所述待測樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；

提取所述混合樣品的核酸；

利用所述混合多重擴增引物和所述混合樣品的核酸進行擴增反應(yīng)，獲得擴增產(chǎn) 物；

利用所述擴增產(chǎn)物進行高通量測序，獲得高通量測序片段；

根據(jù)所述高通量測序片段，對所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物進行定性和 定量分析。

具體地，所述目標(biāo)微生物類群的數(shù)目≥1個，且每個所述目標(biāo)微生物類群包括≥0 種所述目標(biāo)微生物；

所述目標(biāo)微生物為細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體和 原生動物中的至少一種；

所述參考微生物為細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體和 原生動物中的至少一種。

具體地，所述確定待測樣品中的非目標(biāo)生物的方法包括：將所述非目標(biāo)生物確定 為除所述目標(biāo)微生物類群之外的所有生物，若能獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，則 所述非目標(biāo)生物指除所述目標(biāo)微生物類群之外的所有生物；若不能獲得所述目標(biāo)微生物類 群的特征區(qū)域，則所述非目標(biāo)生物指所述混合樣品中，除所述目標(biāo)微生物類群之外的其它 生物。

具體地，所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域為所述目標(biāo)微生物類群內(nèi)的微生物的參 考基因組上的核酸序列；所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述參考基因組 中為單一序列；所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述目標(biāo)微生物類群內(nèi)不 同微生物間保守；所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的區(qū)分度≥3；

所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域同源；所述目標(biāo)微 生物的特征區(qū)域的m2值≥2，其中，m2值為所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與所述目標(biāo)微生物類 群內(nèi)除所述目標(biāo)微生物外的其它所述微生物間的差異堿基數(shù)的最小值；

所述參考微生物的特征區(qū)域為所述參考微生物的參考基因組上的核酸序列；所述 參考微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述參考微生物的參考基因組中為單一序列；所述 參考微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在除所述參考微生物外的其它生物中不具有同源性。