[發明專利]一種鑒別微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標記方法

有效

• 申請號: 201610060768.7
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105548123B
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 陳潔;郭偉;潘國慶;周澤揚;向仲懷
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 王貴君

技術領域

本發明屬于免疫細胞化學技術和熒光顯微技術，具體涉及一種鑒別微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標記方法。

背景技術

家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)是引起蠶業疫病家蠶微粒子病的專性細胞內寄生真核生物。家蠶微孢子蟲大小為2～5μm，其生活史可分為3個階段：感染期、裂殖增殖期、孢子增殖期。感染期為生活史中的胞外期，該時期家蠶微孢子蟲為成熟孢子，在光鏡下具很強折光性，適宜條件下可通過彈出極管注入孢原質或細胞內吞等方式感染宿主細胞。裂殖增殖期的家蠶微孢子蟲未形成孢壁，不含有幾丁質成分，孢子增殖期和感染期的微孢子蟲具有由幾丁質和蛋白組成的孢壁。微孢子蟲的感染常常通過光學顯微鏡觀察感染期的成熟孢子進行診斷(Cali et al.2011)，相差顯微鏡或微分干涉顯微鏡觀察成熟孢子時其折光性很強。研究者們采用了多種方式以易于微孢子蟲觀察，包括采用傳統的染色劑如姬姆薩、革蘭氏和革蘭氏變色酸處理對固定涂片進行制樣(van Gool et al.1993；Moura et al.1997；Strano et al.1976)，通過Calcofluor White M2R等熒光染料處理(Sak et al.2011；Schwartz et al.1992)，或者使用一些特殊的染色方法如格莫瑞六亞甲基四胺銀(GMS)染色、海登海因氏鐵蘇木精染色、萋—尼氏染色(Gray et al.1969；Strano et al.1976)或periodic acid–Schiff(PAS)染色等。但是，這些技術大多僅能便于成熟微孢子蟲的觀察，不能區分微孢子蟲增殖的不同時期。由于正在發育過程中的微孢子蟲體積太小而且位于宿主細胞內，特別是裂殖增殖期的微孢子蟲，很難通過顯微鏡觀察，因此大多數微孢子蟲的結構和發育階段都是在掃描電子顯微鏡(TEM)或者透射電子顯微鏡(SEM)的幫助下，結合免疫膠體金標記及電腦斷層攝影術進行研究的。由于已報道的常規的分辨不同增殖時期的微孢子蟲依賴電子顯微鏡且對技術要求較高，處理過程繁冗耗時，應用具有極大的局限性。因此，急需建立一種簡便、有效的微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的標記方法，以促進微孢子蟲生活史和功能基因組學研究。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種鑒別微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標記方法，該方法操作簡單，使用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡即可實現，打破了對電子顯微鏡的依賴。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

一種鑒別微孢子蟲裂殖增殖期和孢子增殖期的雙色熒光標記方法，包括如下步驟：

(1)將經封閉處理的組織切片或細胞采用β-Tubulin抗體通過間接免疫熒光法標記裂殖增殖期的微孢子蟲；

(2)然后將組織切片或細胞用熒光增白劑染幾丁質的方法標記孢子增殖期的微孢子蟲；

(3)用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡對樣品進行觀察。

經封閉處理的組織切片或細胞可采用現有方法制得，其中封閉處理的細胞由以下方法制得：先將感染微孢子蟲的宿主細胞固定于載玻片上；然后將固定后的細胞采用Triton X-100溶液浸浴細胞，透化15～30min；再將透化后的細胞采用細胞封閉液進行封閉即可。

本發明中，固定的方法為將質量分數為0.01～0.1％的多聚賴氨酸溶液涂抹在載玻片上，風干后得到多聚賴氨酸處理后的載玻片備用；然后將感染微孢子蟲的組織切片或細胞滴加到涂有多聚賴氨酸處理的載玻片上，靜置5min；吸除多余液體，滴加質量分數為4％的多聚甲醛溶液覆蓋細胞固定15min，吸除固定細胞的多余液體，滴加0.01mol/L PBS溶液浸浴細胞，清洗2次，每次3min。

本發明中，所述透化為用體積分數為0.1～2％的Triton X-100溶液透化，優選為用體積分數為2％的Triton X-100溶液透化。

本發明中，所述封閉為滴加封閉液覆蓋細胞，18～37℃處理1h；所述的封閉液為0.05％(V/V)Tween 20，2％(V/V)Triton X-100，0.05％(W/V)BSA和10％(V/V)山羊血清的PBS溶液。