[發(fā)明專利]一種晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞VEGF的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610059901.7
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105510602A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王愛亮;薛雁;李勝;王振丹
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省腫瘤防治研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 濟(jì)南誠智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司 37105
• 代理人: 黎明

1.一種晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞VEGF的檢測方法，其特征在 于，所述的方法為：利用膜過濾裝置分離獲取晚期結(jié)直腸癌患者外周血中 的CTC；運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片；進(jìn)而檢測結(jié)直腸癌患者VEGF基 因表達(dá)情況。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞VEGF的檢 測方法，其特征在于，所述的膜過濾裝置包括濾器(3)、血樣容器(2)、 廢液缸(5)和鐵架臺(1)，所述鐵架臺(1)設(shè)有底座(11)、立架(12) 和支架(13)，所述血樣容器(2)通過支架(13)設(shè)置于鐵架臺(1)上 部，血樣容器(2)的下方為濾器(3)，濾器(3)通過輸液器(4)聯(lián)通 至廢液缸(5)，廢液缸(5)設(shè)置于底座(11)上。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞VEGF的檢 測方法，其特征在于：所述濾器(3)包括濾器上口(6)、濾膜(7)、載 濾膜平臺(8)和濾器下口(9)，濾膜(7)置于載濾膜平臺8上；濾器上 口(6)接血樣容器(2)，濾器下口(9)通過輸液器(4)接廢液缸(5)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞VEGF的檢 測方法，其特征在于：所述濾膜(7)為疏水材料制成，其上均勻布滿口 徑為10微米的濾孔(10)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞VEGF的檢 測方法，其特征在于，所述的利用膜過濾裝置分離獲取晚期結(jié)直腸癌患者 外周血中的CTC，其方法步驟如下：

1)采集晚期結(jié)直腸癌患者外周血：肘正中靜脈血5ml；

2)外周血樣預(yù)處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分： 1mmol/lEDTA+0.1％BSA,稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定 終濃度為0.25％；

3)利用膜過濾分離腫瘤細(xì)胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循環(huán) 腫瘤細(xì)胞：將預(yù)處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細(xì)胞裝置的血樣容 器(2)中，使其依靠重力自然過濾；

4)過濾結(jié)束后，從膜過濾分離腫瘤細(xì)胞裝置中取下濾器(3)，將循 環(huán)腫瘤細(xì)胞染色液A液0.5ml加入到濾器(3)中，染色3min，PBS緩沖液 沖洗干凈；濾液過濾完全后加入B液，1ml，染色2min，純水1ml，沖洗2 次取下濾膜，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞VEGF的檢 測方法，其特征在于，所述的運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片，其方法步 驟如下：

1)脫色：將帶有CTC的濾膜(7)從載玻片上取下，置于脫色液中浸 泡4-6小時，脫去CTC染色液，所述脫色液為：95％酒精與100％二甲苯按 容積比1:1混勻。

2)包裹：浸泡結(jié)束后取出濾膜(7)，用顯微鏡擦鏡紙或?yàn)V紙包裹；

3)固定：將包裹物置于10％中性福爾馬林中，固定4-6h；

4)浸蠟包埋：固定結(jié)束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸 蠟包埋制作細(xì)胞石蠟塊；

5)薄層切片：用切片機(jī)將細(xì)胞石蠟塊連續(xù)切片，制成厚度為4μm的 薄層切片。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞VEGF的檢 測方法，其特征在于，所述的檢測晚期結(jié)直腸癌患者外周血CTC的VEGF 表達(dá)情況，其方法步驟如下：

1)將CTC蠟塊薄層切片在染色缸中按以下步驟進(jìn)行脫蠟和水化：二 甲苯溶液浸泡3次，每次10分鐘；無水乙醇溶液浸泡3次，每次5分鐘； 95％乙醇溶液浸泡5分鐘；85％乙醇溶液浸泡5分鐘；75％乙醇溶液浸泡5 分鐘；蒸餾水浸泡2次，每次3分鐘；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3分 鐘；

2)采用檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)法對組織抗原進(jìn)行修復(fù)：取 pH＝6.0檸檬酸鹽緩沖液800-1500ml于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰，將 脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫不銹鋼切片架上，放入已沸騰的緩沖液 中，鍋蓋繼續(xù)加熱至噴汽開始計(jì)時，噴汽1-2分鐘后，壓力鍋離開熱源， 冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS 沖洗兩次，每次各5分鐘；

3)3％H₂O₂去離子水孵育5分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3 次，每次3分鐘；

4)滴加VEGF一抗，室溫或37℃孵育1-2小時或4℃過夜，PBS沖洗3 次，每次5分鐘；

5)滴加通用型生物素化二抗，室溫或37℃孵育60分鐘，PBS沖洗3 次，每次3分鐘；

6)應(yīng)用DAB溶液顯色：甩去PBS液，每張切片加2滴或100μl新鮮 配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察5-10分鐘；

7)蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明封片：蒸餾水沖洗2次，每次3分 鐘；蘇木素復(fù)染1分鐘；0.1％鹽酸酒精分化；0.1％氨水溶液返藍(lán)；50％、70％、 85％、95％無水乙醇脫水干燥；二甲苯透明，中性樹脂膠封片；

8)細(xì)胞病理學(xué)專家閱片，根據(jù)細(xì)胞著色程度判定VEGF表達(dá)情況。