[發明專利]一種腎癌患者外周血VEGF的檢測方法

在審

• 申請號: 201610059535.5
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105548569A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 李勝;孫萍;王振丹
• 申請（專利權）人: 山東省醫學科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 黎明

1.一種腎癌患者外周血VEGF的檢測方法，其特征在于，利用膜過濾裝置分 離獲取晚期腎癌患者外周血中的CTC；運用細胞蠟塊技術制作薄層切片； 進而檢測腎癌患者VEGF基因表達情況。

2.根據權利要求1所述的腎癌患者外周血VEGF的檢測方法，其特征在于， 所述的膜過濾裝置包括濾器(3)、血樣容器(2)、廢液缸(5)和鐵架臺 (1)，所述鐵架臺(1)設有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述 血樣容器(2)通過支架(13)設置于鐵架臺(1)上部，血樣容器(2) 的下方為濾器(3)，濾器(3)通過輸液器(4)聯通至廢液缸(5)，廢液 缸(5)設置于底座(11)上。

3.根據權利要求2所述的腎癌患者外周血VEGF的檢測方法，其特征在于： 所述濾器(3)包括濾器上口(6)、濾膜(7)、載濾膜平臺(8)和濾器下 口(9)，濾膜(7)置于載濾膜平臺8上；濾器上口(6)接血樣容器(2)， 濾器下口(9)通過輸液器(4)接廢液缸(5)。

4.根據權利要求3所述的腎癌患者外周血VEGF的檢測方法，其特征在于： 所述濾膜(7)為疏水材料制成，其上均勻布滿口徑為10微米的濾孔(10)。

5.根據權利要求1所述的腎癌患者外周血VEGF的檢測方法，其特征在于， 所述的利用膜過濾裝置分離獲取晚期腎癌患者外周血中的CTC，步驟如下：

1)采集晚期腎癌患者外周血：肘正中靜脈5ml；

2)外周血樣預處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分： 1mmol/lEDTA+0.1％BSA,稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固 定終濃度為0.25％；

3)利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循 環腫瘤細胞：將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血 樣容器(2)中，使其依靠重力自然過濾；

4)過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器(3)，將 循環腫瘤細胞染色液加入到濾器(3)中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干 凈，取下濾膜(7)，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定CTC 是否存在。

6.根據權利要求1所述的腎癌患者外周血VEGF的檢測方法，其特征在于， 所述的運用細胞蠟塊技術制作薄層切片，步驟如下：

1)脫色：將帶有CTC的濾膜(7)從載玻片上取下，置于脫色液中 浸泡4-6小時，脫去CTC染色液，所述脫色液為：95％酒精與100％二甲苯 按體積比1:1混勻。

2)包裹：浸泡結束后取出濾膜(7)，用用吸水紙包裹；

3)固定：將包裹物置于10％中性福爾馬林中，固定4-6h；

4)浸蠟包埋：固定結束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中， 浸蠟包埋制作細胞石蠟塊；

5)薄層切片：用切片機將細胞石蠟塊連續切片，制成厚度為4μm 的薄層切片。

7.根據權利要求1所述的腎癌患者外周血VEGF的檢測方法，其特征在于， 所述的檢測腎癌患者VEGF基因表達情況，步驟如下：

1)將CTC蠟塊薄層切片在染色缸中按以下步驟進行脫蠟和水化：二 甲苯溶液浸泡3次，每次10分鐘；無水乙醇溶液浸泡3次，每次5分鐘； 95％乙醇溶液浸泡5分鐘；85％乙醇溶液浸泡5分鐘；75％乙醇溶液浸泡5 分鐘；蒸餾水浸泡2次，每次3分鐘；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3 分鐘；

2)采用檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復法對組織抗原進行修復：取 pH＝6.0檸檬酸鹽緩沖液800-1500ml于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰， 將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫不銹鋼切片架上，放入已沸騰的緩 沖液中，鍋蓋繼續加熱至噴汽開始計時，噴汽1-2分鐘后，壓力鍋離開 熱源，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用pH＝7.2-7.4 的PBS沖洗兩次，每次各3分鐘；

3)3％H₂O₂去離子水孵育5分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗 3次，每次2分鐘；

4)滴加VEGF一抗，室溫或37℃孵育1-2小時或4℃過夜，PBS沖洗 3次，每次2分鐘；

5)滴加通用型IgG抗體，室溫或37℃孵育15分鐘，PBS沖洗3次， 每次2分鐘；

6)應用DAB溶液顯色：甩去PBS液，每張切片加2滴或100μl新 鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘；

7)蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明封片：蒸餾水沖洗2次，每次3 分鐘；蘇木素復染1分鐘；0.1％鹽酸酒精分化；0.1％氨水返藍；梯度為 100％、95％、90％乙醇脫水干燥；二甲苯透明，中性樹脂膠封片；

8)細胞病理學專家閱片，根據細胞著色程度判定VEGF表達情況。