[發(fā)明專利]一種玉米圓斑病病原物的快速檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610059447.5
• 申請(qǐng)日: 2016-01-28
• 公開（公告）號(hào): CN105525011A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張猛;馬慶周;耿月華;武海燕;孫斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 鄭州優(yōu)盾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41125
• 代理人: 張紹琳;張真真

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種特異性引物的快速檢測(cè)病原物的方法，具體涉及一種玉米圓斑病特異性引物快速檢測(cè)病原物的方法。

背景技術(shù)

玉米生平臍蠕孢[Bipolariszeicola(G.L.Stout)Shoemaker，有性態(tài)為CochlioboluscarbonumR.R.Nelson]，又稱玉米圓斑病菌。該菌菌落黑褐色，輪紋狀展開，表面及邊緣顏色稍淺，氣生菌絲短，產(chǎn)孢量大；分生孢子梗中度黃褐色，頂端色淺，屈膝狀彎曲，單生或簇生，有時(shí)分支，寬3.0-5.0μm；分生孢子暗褐色，頂端和基細(xì)胞顏色相對(duì)淺，窄橢圓形或近圓柱形，直或微彎，中部略寬，兩端稍窄，基細(xì)胞鈍圓，光滑，6-11個(gè)(多9個(gè))假隔膜，65.5-97.5×12.0-15.5μm，平均：82.2×13.3μm；臍部略突出，明顯，基部平截。

該病原菌能夠引起玉米圓斑病，是廣泛發(fā)生于玉米產(chǎn)區(qū)的一種較為嚴(yán)重的葉部病害。主要危害玉米葉部和果穗，侵染引起葉斑病(Northerncornleafspot)和穗腐(earrot)。1926年在美國伊利諾伊州首次發(fā)現(xiàn)其引起莖腐病(stalkrot)，1938年在美國印第安納州種植的自交系“Pr”上造成嚴(yán)重影響，隨后在塞爾維亞等30多個(gè)國家相繼發(fā)生；在中國，1974年玉米圓斑病首次在吉林省農(nóng)安縣發(fā)現(xiàn)，由于大面積種植感病玉米品種，玉米圓斑病在吉林省曾多次大面積暴發(fā)成災(zāi)，成為當(dāng)時(shí)限制玉米生產(chǎn)的主要病害之一。20世紀(jì)90年代陸續(xù)在我國臺(tái)灣、浙江、陜西、河北、黑龍江、遼寧和內(nèi)蒙古等省、自治區(qū)發(fā)現(xiàn)該病。但由于大面積種植玉米圓斑病的抗病品種，此病發(fā)生并不嚴(yán)重，常年發(fā)病率只有10％～20％。近些年來，由于環(huán)境氣候的改變，該病在四川省、陜西省、云南省、重慶市、河北等地發(fā)生，并有加重趨勢(shì)。因此，盡早快速的檢測(cè)該病原菌對(duì)減輕該病害造成的損失具有重要的意義。平臍蠕孢類病菌的分類和鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定等。傳統(tǒng)的病菌鑒別方法耗時(shí)長、靈敏度低以及經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)，發(fā)病植株中分離并鑒定病原菌需要數(shù)天時(shí)間，難以做到對(duì)病害發(fā)生的及時(shí)監(jiān)測(cè)和有效控制病原菌的傳播與病害流行。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不同分子技術(shù)用于植物蠕孢類病害的檢測(cè)。通過比對(duì)所測(cè)序的玉米生平臍蠕孢菌與GenBank中平臍蠕孢屬中其它幾個(gè)種的EF-1α基因的部分序列，利用DNAMAN設(shè)計(jì)出了可用于檢測(cè)玉米生平臍蠕孢菌的特異性引物，為從玉米葉片中快速、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)玉米生平臍蠕孢菌潛伏侵染與否奠定了基礎(chǔ)，有利于及早有效的采取防治措施。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：玉米圓斑病菌能夠引起玉米圓斑病，是廣泛發(fā)生于玉米產(chǎn)區(qū)的一種較為嚴(yán)重的葉部病害，近些年來，由于環(huán)境氣候的改變，該病在四川省、陜西省、云南省、重慶市、河北等地發(fā)生，并有加重趨勢(shì)。因此，盡早快速的檢測(cè)該病原菌對(duì)減輕該病害造成的損失具有重要的意義，本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)玉米圓斑病的特異性引物及使用方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種玉米圓斑病病原物的快速檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)真菌菌絲的收集；

(2)真菌DNA的提??；

(3)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為，正向引物Y-EF和反向引物Y-ER各1μL，DNA模板1μL，TaqPCRMasterMix12.5μL，ddH₂O補(bǔ)至25μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

所述正向引物Y-EF序列如SEQIDNO：1所示，反向引物Y-ER序列如SEQIDNO：2所示。

所述正向引物和反向引物的濃度為5μmol/μL，DNA模板濃度為25ng/μL，TaqPCRMasterMix購自上海萊楓生物科技有限公司，所述TaqPCRMasterMix含有0.1μ/μLTaqDNApolymerase，0.4mMeachdNTP，2×TaqBuffer，PCR增強(qiáng)劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。

一種玉米圓斑病病原物的快速檢測(cè)方法作為玉米葉片中圓斑病病原菌監(jiān)測(cè)的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：為從玉米葉片中快速、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)玉米平臍蠕孢菌潛伏侵染與否奠定基礎(chǔ)，有利于及早有效的采取防治措施。

附圖說明