[發明專利]晚期乳腺癌患者外周血循環腫瘤細胞ER基因的檢測方法

有效

• 申請號: 201610058960.2
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105510600B
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 孫萍;戴亮;李勝;王振丹
• 申請（專利權）人: 山東省藥物研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司37105
• 代理人: 黎明

1.一種晚期乳腺癌患者外周血循環腫瘤細胞ER基因非診斷目的的檢測方法，其特征在于，利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環腫瘤細胞；運用細胞蠟塊技術制作薄層切片；進而檢測晚期乳腺癌患者外周血循環腫瘤細胞的ER表達情況；

所述的利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血循環腫瘤細胞，步驟如下：

1)采集晚期乳腺癌癥患者外周血：肘正中靜脈5ml；

2)將外周血樣進行預處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA，稀釋后用4％多聚甲醛固定外周血樣10分鐘；

3)利用膜過濾裝置分離外周血樣，富集外周血循環腫瘤細胞：將預處理的外周血樣加入到膜過濾裝置的血樣容器(2)中，使其依靠重力自然過濾；

4)過濾結束后，從膜過濾裝置中取下濾器(3)，PBS沖洗2-3次，外周血循環腫瘤細胞被截留在濾膜(7)上；

所述的鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環腫瘤細胞，步驟如下：

1)向分離獲取外周血循環腫瘤細胞的濾器(3)中加入Cytoperm/Cytofix試劑300μl，固定、穿孔15min；

2)PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后加入wash buffer 300μl，封閉30min；

3)加入CK8/18/19、CD45一抗混懸液300μl，三種一抗均以wash buffer稀釋，混勻后的終濃度為1:250，室溫下孵育45min；

4)Wash buffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入二抗混懸液300μl，三種二抗均以wash buffer稀釋，混勻后的終濃度為1:500，室溫下避光孵育30min；

5)Wash buffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入Hoechst 300μl，洗染細胞核5min；

6)PBS漂洗2次，每次3分鐘，之后取出濾膜(7)置于載玻片上，滴加10μl抗熒光淬滅封閉液封片；

7)熒光顯微鏡下2h內觀察結果，拍照、記錄CTC情況，確定是否存在CTC；

所述的運用細胞蠟塊技術制作薄層切片，步驟如下：

1)外周血過濾后，從過濾裝置中取下濾器(3)，打開并移走濾器上口(6)，將循環腫瘤細胞染色液加入到濾器(3)中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干凈，用眼科鑷子取下濾膜(7)，放置在載玻片上，適當干燥后在顯微鏡下觀察,證實存在CTC；

2)制作薄層切片：

A、脫色：將上述帶有CTC的濾膜(7)從載玻片上取下，置于95％酒精與100％二甲苯按體積比1:1混勻的脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液；

B、包裹：浸泡結束后取出濾膜(7)，用吸水紙包裹；

C、固定：將包裹物置于10％中性福爾馬林中，固定4-6h；

D、浸蠟包埋：固定結束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細胞石蠟塊；

E、薄層切片：用切片機將細胞石蠟塊連續切片，制成厚度為2-4μm的薄層切片；

所述的檢測晚期乳腺癌患者外周血循環腫瘤細胞的ER表達情況，步驟如下：

1)烤片：CTC蠟塊薄層切片在60℃恒溫箱中烤片2小時；

2)脫蠟：切片于兩瓶二甲苯中分別放置5分鐘；

3)水化：將切片依次在無水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分別放置1分鐘，自來水、蒸餾水沖洗；

4)抗原修復：將高壓鍋內的修復液EDTA煮沸，放入切片至完全沒入修復液蓋上高壓鍋蓋及壓力閥，加熱至高壓鍋噴氣后1.5分鐘，離火，將高壓鍋稍冷卻打開鍋蓋，切片在修復液中自然冷卻；

5)蒸餾水沖洗；

6)去除內源性過氧化物酶：用3％H2O2作用切片10分鐘；

7)蒸餾水沖洗；

8)PBS浸洗5次各1.5分鐘；

9)滴加ER一抗，4℃冰箱中過夜，然后將其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分鐘；

10)滴加二抗；

11)37℃水浴鍋中孵育20分鐘；

12)PBS浸洗5次各1.5分鐘；

13)顯微鏡下控制，DAB顯色；

14)自來水沖洗，蘇木精染液復染2分鐘，鹽酸酒精分化，氨水返藍；

15)自來水沖洗5分鐘；

16)75％-95％-100％梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片；

17)細胞病理學專家閱片，判讀ER表達情況。