[發(fā)明專利]一種腎癌患者外周血Vimentin檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610058656.8
• 申請(qǐng)日: 2016-01-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105699657B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒本奎;李勝;王振丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省腫瘤防治研究院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 濟(jì)南誠(chéng)智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司37105
• 代理人: 黎明

1.一種腎癌患者外周血Vimentin非診斷目的的檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)方法步驟如下：利用膜過(guò)濾裝置分離獲得無(wú)法獲取組織標(biāo)本的晚期腎癌患者外周血中的CTC，運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片，進(jìn)而檢測(cè)Vimentin表達(dá)情況；

所述的利用膜過(guò)濾裝置分離獲得無(wú)法獲取組織標(biāo)本的晚期腎癌患者外周血中的CTC，步驟如下：

1)采集晚期腎癌患者外周血：肘正中靜脈5ml；

2)外周血樣預(yù)處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25％；

3)利用膜過(guò)濾分離腫瘤細(xì)胞裝置過(guò)濾外周血樣，分離獲得外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：將預(yù)處理的外周血樣加入到膜過(guò)濾分離腫瘤細(xì)胞裝置的血樣容器(2)中，使其依靠重力自然過(guò)濾；

4)過(guò)濾結(jié)束后，從膜過(guò)濾分離腫瘤細(xì)胞裝置中取下濾器(3)，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞染色液加入到濾器(3)中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干凈，用精細(xì)鑷子取下濾膜(7)，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC；

所述的運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片，步驟如下：

1)脫色：將上述載玻片上的濾膜(7)取下，置于脫色液中浸泡4-6小時(shí)，脫去CTC染色液，所述脫色液為：95％酒精與100％二甲苯按體積比1:1混勻；

2)包裹：浸泡結(jié)束后取出濾膜(7)，用吸水紙包裹；

3)固定：將包裹物置于10％中性福爾馬林中，固定4-6h；

4)浸蠟包埋：固定結(jié)束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細(xì)胞石蠟塊；

5)薄層切片：用切片機(jī)將細(xì)胞石蠟塊連續(xù)切片，制成厚度為4μm的薄層切片；

所述的檢測(cè)Vimentin表達(dá)情況，步驟如下：

1)將CTC蠟塊薄層切片在染色缸中按以下步驟進(jìn)行脫蠟和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分鐘；無(wú)水乙醇溶液浸泡3次，每次5分鐘；95％乙醇溶液浸泡5分鐘；85％乙醇溶液浸泡5分鐘；75％乙醇溶液浸泡5分鐘；蒸餾水浸泡2次，每次3分鐘；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3分鐘；

2)采用檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)法對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)：取pH＝6.0檸檬酸鹽緩沖液800-1500ml于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫不銹鋼切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋繼續(xù)加熱至噴汽開(kāi)始計(jì)時(shí)，1-2分鐘后，壓力鍋離開(kāi)熱源，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS沖洗兩次，每次各3分鐘；

3)3％H₂O₂去離子水孵育5分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次，每次2分鐘；

4)滴加Vimentin一抗，室溫或37℃孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次2分鐘；

5)滴加通用型IgG抗體，室溫或37℃孵育15分鐘，PBS沖洗3次，每次2分鐘；

6)應(yīng)用DAB溶液顯色：甩去PBS液，每張切片加2滴或100μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘；

7)蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明封片：蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘；蘇木素復(fù)染1分鐘；0.1％鹽酸酒精分化；0.1％氨水返藍(lán)；50％、70％、85％、95％、無(wú)水乙醇脫水干燥；二甲苯透明，中性樹(shù)脂膠封片；

8)細(xì)胞病理學(xué)專家閱片，根據(jù)細(xì)胞著色程度判定Vimentin表達(dá)情況。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腎癌患者外周血Vimentin非診斷目的的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的膜過(guò)濾裝置包括濾器(3)、血樣容器(2)、廢液缸(5)和鐵架臺(tái)(1)，所述鐵架臺(tái)(1)設(shè)有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述血樣容器(2)通過(guò)支架(13)設(shè)置于鐵架臺(tái)(1)上部，血樣容器(2)的下方為濾器(3)，濾器(3)通過(guò)輸液器(4)聯(lián)通至廢液缸(5)，廢液缸(5)設(shè)置于底座(11)上。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腎癌患者外周血Vimentin非診斷目的的檢測(cè)方法，其特征在于：所述濾器(3)包括濾器上口(6)、濾膜(7)、載濾膜平臺(tái)(8)和濾器下口(9)，濾膜(7)置于載濾膜平臺(tái)(8)上；濾器上口(6)接血樣容器(2)，濾器下口(9)通過(guò)輸液器(4)接廢液缸(5)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腎癌患者外周血Vimentin非診斷目的的檢測(cè)方法，其特征在于：所述濾膜(7)為疏水材料制成，其上均勻布滿口徑為10微米的濾孔(10)。