[發(fā)明專利]晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PR基因的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610058588.5
• 申請(qǐng)日: 2016-01-28
• 公開（公告）號(hào): CN105606823B
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫萍;李勝;仇紅;王振丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省腫瘤防治研究院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/574;G01N33/569
• 代理公司: 濟(jì)南誠智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司37105
• 代理人: 黎明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)PR基因的新方法，尤其是通過外周血檢測(cè)晚期乳腺癌患者PR基因的方法。

背景技術(shù)

目前作為預(yù)后因子的孕激素受體(Progesterone Receptor，PR)是ER的產(chǎn)物，可以引起和增強(qiáng)雌激素對(duì)ER的反應(yīng)，起到促進(jìn)和協(xié)同的作用，其已成為制定乳腺癌患者內(nèi)分泌治療方案時(shí)最重要的指標(biāo)，只有ER陽性時(shí)，內(nèi)分泌治療有效率為50％-60％，如果ER、PR均為陽性時(shí)，有效率可高達(dá)70％-80％，而同時(shí)陰性者有效率為10％。現(xiàn)有的乳腺癌PR的檢測(cè)需要通過手術(shù)或穿刺活檢等方式獲得原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤組織標(biāo)本，然而不是每一位患者都能獲得腫瘤組織樣本，而且不能在治療過程中進(jìn)行連續(xù)的檢測(cè)，限制了其成為有效的療效監(jiān)測(cè)指標(biāo)。但脫落入血的CTC可以給我們提供潛在的實(shí)時(shí)腫瘤標(biāo)本，其突變狀態(tài)同樣可以用于指導(dǎo)治療。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cell，CTC)是從實(shí)體腫瘤脫落而進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，它存在于乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中，其檢測(cè)對(duì)于評(píng)估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預(yù)后以及選擇合適的個(gè)體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測(cè)具有微創(chuàng)、實(shí)時(shí)等特點(diǎn)，被稱為“液態(tài)活檢”。

目前CTCs檢測(cè)的主要方法包括依賴腫瘤相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及基于形態(tài)學(xué)富集的膜過濾技術(shù)(Isolating by size of epithelial tumor cells，ISET)。前者是基于細(xì)胞表面表達(dá)不同抗原標(biāo)志，將針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原的特異性抗體EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別，借助外加磁場(chǎng)篩選富集CTCs。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于特異度較高，已有商品化的半自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備(CellSearch)；但腫瘤特異性抗原表達(dá)的缺失會(huì)造成假陰性結(jié)果。后者是根據(jù)細(xì)胞大小的差異，利用過濾的方法將體積較大的腫瘤細(xì)胞篩選富集。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于方法簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，分離獲得的CTCs具有活性可用于后續(xù)研究；但由于缺乏形態(tài)學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn)，該富集技術(shù)特異性相對(duì)較差。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服傳統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)及晚期乳腺癌患者不適宜組織標(biāo)本取材--進(jìn)而無法評(píng)估患者PR狀態(tài)的不足，本發(fā)明提供了一種晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PR基因的檢測(cè)方法：利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞；運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片；進(jìn)而通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的PR表達(dá)情況。

該方法具體步驟如下：

一、利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：

1、采集晚期乳腺癌癥患者外周血：肘正中靜脈10ml，均分為2管編寫相同編號(hào)后，分別命名為實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組；

2、將2管外周血樣分別進(jìn)行預(yù)處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀釋后用4％多聚甲醛固定外周血樣10分鐘；

3、利用膜過濾裝置分離外周血樣，富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：將預(yù)處理的外周血樣加入到膜過濾裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；

4、過濾結(jié)束后，從膜過濾裝置中取下濾器，PBS沖洗2-3次，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞被截留在濾膜上。

二、利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：

1、向?qū)嶒?yàn)1組分離獲取外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的濾器中加入Cytoperm/Cytofix試劑300μl，固定、穿孔15min；

2、PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后加入wash buffer 300μl，封閉30min；

3、加入CK8/18/19、CD45一抗混懸液300μl，兩種一抗均以wash buffer稀釋，混勻后的終濃度為1:250，室溫下孵育45min；

4、Wash buffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入二抗混懸液300μl，兩種二抗均以wash buffer稀釋，混勻后的終濃度為1:500，室溫下避光孵育30min；

5、Wash buffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入Hoechst 300μl，洗染細(xì)胞核5min；

6、PBS漂洗2次，每次3分鐘，之后取出濾膜置于載玻片上，滴加10μl抗熒光淬滅封閉液封片；

7、熒光顯微鏡下2h內(nèi)觀察結(jié)果，拍照、記錄CTC情況，確定是否存在CTC；如觀察到CTC則繼續(xù)進(jìn)行下一步檢測(cè)，否則停止檢測(cè)。

三、運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作CTC細(xì)胞蠟塊：