[發(fā)明專利]甘蔗脫毒健康種苗無(wú)菌外植體的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610058186.5
• 申請(qǐng)日: 2016-01-28
• 公開（公告）號(hào): CN105613298B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐利球;馬文清;陳海生;羅晟昇;秦昌鮮;韋海球;蔣亞琴;江清梅;廖韋衛(wèi);何洪良;彭崇;黃珍玲;閉德金;莫周美;郭強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 廣西南寧公平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于甘蔗脫毒健康種苗快繁生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種甘蔗脫毒健康種苗無(wú)菌外植體的制備方法。

背景技術(shù)

甘蔗脫毒健康種苗一般指通過(guò)生物技術(shù)手段而獲得的不攜帶甘蔗宿根矮化病和甘蔗花葉病病原物(以下簡(jiǎn)稱病原物)的甘蔗種苗，其常規(guī)技術(shù)流程如下：病原物的去除→無(wú)菌外植體的建立→叢生芽的誘導(dǎo)→病原檢測(cè)→健康種苗增殖快繁→生根培養(yǎng)→一級(jí)苗圃沙床假植→二級(jí)苗圃營(yíng)養(yǎng)杯假植→大田一級(jí)種苗田擴(kuò)繁→病原檢測(cè)→合格種苗大田二級(jí)種苗田擴(kuò)繁→病原檢測(cè)→合格種苗大田三級(jí)種苗田擴(kuò)繁→病原檢測(cè)→合格種苗，合格種苗即可作為生產(chǎn)用種。在抗甘蔗宿根矮化病和甘蔗花葉病的甘蔗優(yōu)良新品種面世之前，甘蔗脫毒健康種苗的應(yīng)用將始終是一項(xiàng)防治甘蔗病原物最為實(shí)用和有效的方法，也是世界上各個(gè)甘蔗種植國(guó)家都在進(jìn)行研究和利用的技術(shù)措施。

從上述技術(shù)流程可看出，要培育出合格的甘蔗脫毒健康種苗，無(wú)菌外植體的的制備是整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是實(shí)現(xiàn)工廠化育苗的前提。陳仲華等通過(guò)熱水處理結(jié)合心葉愈傷組織培養(yǎng)，從而建立了一種甘蔗脫毒健康種苗快繁體系，該體系的外植體的制備步驟與常規(guī)植物組培外植體的制備步驟基本相同，其過(guò)程必須使用到消毒劑氯化汞等。楊本鵬等通過(guò)熱水處理結(jié)合1～2mm的莖尖培養(yǎng)的建立了另一種甘蔗脫毒健康種苗培養(yǎng)體系，其外植體的制備過(guò)程同樣使用到氯化汞。目前，甘蔗脫毒健康種苗外植體的制備階段的方法與上述兩種方法大同小異。發(fā)明人通過(guò)多年實(shí)踐，認(rèn)為上述兩種外植體的制備方法存在如下缺陷：第一種方法的心葉愈傷組織培養(yǎng)出的后代種苗易產(chǎn)生變異，不利于種苗質(zhì)量穩(wěn)定；第二種方法以1～2mm大小的莖尖作為外植體，取材難度較大，對(duì)技術(shù)要求較高，且后續(xù)的誘導(dǎo)培養(yǎng)極易出現(xiàn)消毒劑藥害及酚類褐化死亡現(xiàn)象，取材及誘導(dǎo)培養(yǎng)成功率較低；同時(shí)，兩種方法均使用到氯化汞進(jìn)行外植體消毒，若操作過(guò)程處理不當(dāng)，對(duì)操作人員的健康及生態(tài)環(huán)境均存在潛在不利影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生態(tài)、環(huán)保且簡(jiǎn)便易行的甘蔗脫毒健康種苗無(wú)菌外植體的制備方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：甘蔗脫毒健康種苗無(wú)菌外植體的制備方法，取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲為害的植株分割成單芽段，置于52℃溫湯中恒溫浸泡2h后種植于無(wú)菌種源圃；5～7個(gè)月后，連續(xù)晴天3天以上，取無(wú)病原物植株甘蔗的稍部，采用無(wú)菌操作切取莖尖端作為無(wú)菌外植體。

上述甘蔗脫毒健康種苗無(wú)菌外植體的制備方法，按以下技術(shù)流程進(jìn)行：熟期甘蔗大田→選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲為害的植株→單芽段→52℃溫湯浸泡2h→無(wú)菌種源圃種植5～7個(gè)月→病原物檢測(cè)→連續(xù)晴天3天以上，取無(wú)病原物植株甘蔗的稍部→去除外部包裹的4～5片葉鞘后移至接種室→在超凈工作臺(tái)上每去除一片葉鞘，用75％酒精對(duì)外植體基部往尾部擦拭一遍直至露出莖尖端→切取莖尖端0.5～1cm左右的組織接種于外植體培養(yǎng)基上→其它步驟同常規(guī)培養(yǎng)。

無(wú)菌種源圃為防蟲網(wǎng)包圍在棚架結(jié)構(gòu)四周形成的與外界隔絕的封閉空間，其目的在于防止病蟲對(duì)種源圃內(nèi)培養(yǎng)的植株感染。

防蟲網(wǎng)規(guī)格為60目。

棚架結(jié)構(gòu)高為4～6m，采用竹竿、塑料管或不銹鋼管制作。

針對(duì)目前甘蔗脫毒健康種苗無(wú)菌外植體制備存在取材困難和消毒隱患等問(wèn)題，發(fā)明人建立了一種甘蔗脫毒健康種苗無(wú)菌外植體的制備方法，取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲為害的植株分割成單芽段，置于52℃溫湯中恒溫浸泡2h后種植于無(wú)菌種源圃；5～7個(gè)月后，連續(xù)晴天3天以上，取無(wú)病原物植株甘蔗的稍部，采用無(wú)菌操作切取莖尖端作為無(wú)菌外植體。本發(fā)明與常規(guī)的外建方法最大的區(qū)別在于省去了氯化汞消毒步驟，原因在于：首先，甘蔗梢部本身由層層緊密包裹的葉鞘組成，包裹在其中的莖尖端自然處于無(wú)菌狀態(tài)，只要取材過(guò)程進(jìn)行常規(guī)的無(wú)菌操作，避免使用帶菌的器械接觸到莖尖端組織，即可取得無(wú)菌外植體；另外，由于單芽段經(jīng)過(guò)52℃溫湯浸泡2h，已徹底去除了其中的病原物，因此，只要后續(xù)的生長(zhǎng)過(guò)程不被病原物再次浸染即可獲得無(wú)病原物的植株，其取材的大小跟去除病原物已無(wú)關(guān)，因此可以取較大的莖尖作為外植體。本發(fā)明生態(tài)、環(huán)保且簡(jiǎn)便易行，為甘蔗脫毒健康苗規(guī)模化生產(chǎn)提供了無(wú)菌外植體取材的好方法。應(yīng)用本發(fā)明可以降低技術(shù)操作門檻，省去外植體消毒環(huán)節(jié)，使生產(chǎn)過(guò)程較為生態(tài)和環(huán)保且可以工廠化培育出質(zhì)量穩(wěn)定，無(wú)變異的甘蔗脫毒健康種苗；同時(shí)，取材的甘蔗外植體更有利于后續(xù)階段的培養(yǎng)，也有利于培育質(zhì)量穩(wěn)定的后代種苗且易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式