[發明專利]脂肪干細胞的制備及應用

在審

• 申請號: 201610056960.9
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105505866A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 周濱
• 申請（專利權）人: 周濱
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P3/10
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 劉立春

技術領域

本發明屬于一種藥物制備以及用途領域，具體涉及自體脂肪干細胞的制備以及治療II型 糖尿病用途。

背景技術

目前臨床上II型糖尿病的治療，目的是降低血糖，控制并發癥。采取的措施是口服降糖 藥、注射胰島素、控制飲食、適當運動。然而上述方法無法完全修復胰島，當然無法控制這 些疾病的進一步發展。而脂肪干細胞療法不僅能促進受損的胰島組織修復；而且能調節免疫 平衡，避免免疫損傷，是一種標本皆治的好方法，屬于生物醫療技術的重大創新。

與現有的胚胎干細胞、iPS多能干細胞和骨髓干細胞相比較，脂肪干細胞不僅具有各類干 細胞具有的優勢，還具有取材方便、創傷小、來源充足，一次可以獲得大量新鮮的干細胞， 自體使用沒有免疫排斥反應等優點，而且避開了胚胎干細胞的倫理學困擾和骨髓干細胞的來 源稀缺等麻煩。在臨床和再生醫學方面，脂肪干細胞取代其他各類干細胞服務于病人，成為 必然的趨勢。

發明內容

脂肪干細胞分離：去除抽取的人體脂肪組織的下層血性腫脹液，將脂肪以500G離心3-5 分鐘，去除離心后脂肪上層油脂和底層血性液體，獲取中層純脂肪，按體積比1:1加入0.1％ 膠原酶溶液充分混勻后放入37℃搖床，并以200rpm消化30-40分鐘，消化結束后再以800G 離心5-10分鐘后獲得干細胞沉淀，加入對應的患者血清10ml，充分混勻后加入以干細胞沉淀 和生理鹽水的體積比1:5加入生理鹽水，再以300G離心3-5分鐘，離心后去除上層溶液，剩 余底部沉淀，以體積比1:7加入生理鹽水，再以300G離心3-5分鐘，重復3遍后，將最后得 到沉淀通過100μm濾器過濾，得到的濾液為脂肪干細胞溶液。

脂肪干細胞培養：將脂肪干細胞加入由10％胎牛血清、1％青霉素及1％鏈霉素原液構成 的高糖DMEM培養基重懸，并用100目濾網過濾，將細胞懸液接種于培養瓶中，在37℃、 飽和濕度、5％CO₂培養箱中培養。48小時后換液，去除未貼壁細胞，此后每72小時換液1 次，至細胞融合至80％后棄去原培養液，PBS洗滌1次，加入適量0.25％胰蛋白酶+0.03％ EDTA進行消化3-5分鐘，加入高糖DMEM培養基終止消化，以800r/min離心5分鐘， 用含10％胎牛血清、1％青霉素及1％鏈霉素原液構成的高糖DMEM培養基重懸沉積細胞， 按1:2的比例進行傳代，當傳代細胞生長接近單層融合70％時，可繼續傳代，傳至第三代終 止。

將得到的脂肪干細胞以1.0×10⁶個/公斤體重通過靜脈注射治療II型糖尿病。

附圖說明

圖1成脂誘導分化檢測圖

圖2成骨誘導分化檢測圖

圖3成軟骨誘導分化檢測圖

具體實施方式

(1)脂肪組織的采集：患者術前檢查常規檢查無異常后進行抽脂手術。對于手術部位的選擇： 大腿內側及髂腰最好，使用3mm抽脂管連接20ml注射器進行抽脂，抽脂量1000ml。

(2)脂肪干細胞的分離提取：

脂肪干細胞分離：去除下層血性腫脹液后，將脂肪以500G，3min離心，離心后脂肪分 三層，底層為血性液體，中層為純脂肪，上層為油脂層，去除上層油脂和底層血性液體，獲 取中層純脂肪，按體積比1:1加入0.1％膠原酶充分混勻后放入37℃，200rpm搖床搖勻消化 30min，消化結束后放入800G，5min離心，離心后去除上層消化后的脂肪及溶液，剩余底部 5ml干細胞沉淀，取出37℃恒溫箱內的患者血清，加入上述5ml干細胞沉淀用以中和膠原酶， 充分混勻后加入生理鹽水至40ml，再以300G，3min離心，離心后去除上層溶液，剩余底部 5ml沉淀，再次加入生理鹽水至40ml以300G，3分鐘離心，重復3遍后，將最后得到5ml 沉淀通過100μm濾器過濾，得到脂肪干細胞溶液3.6ml。

(3)培養：