[發明專利]一種非經典分泌蛋白及其在蛋白分泌表達中的應用

有效

• 申請號: 201610056025.2
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105602925B
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 張大偉;陳景奇;趙留群;孫際賓
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/75;C12N15/65
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1.一種利用非經典分泌蛋白實現目標蛋白分泌表達的方法，其特征在于：所述非經典分泌蛋白為RDPE，其是來源于瘤胃菌(Ruminococcus sp.)5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向異構酶，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RDPE不含有任何經典的信號肽和分泌信號序列，該方法包括以下步驟：

(1)根據Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA的DPEase編碼基因rdpe序列進行全基因合成，并在該基因核苷酸序列的5’和3’端分別引入NdeI和BamHI限制性酶切位點，合成好的基因連接到pUC57載體上，獲得pUC57-RDPE；

(2)將質粒pUC57-RDPE和pMA5分別進行NdeI和BamHI雙酶切處理，膠回收后得到兩端分別帶有NdeI和BamHI酶切位點的rdpe片段和線性化的pMA5載體，將兩者以T4連接酶進行連接，然后轉化大腸桿菌DH5α獲得pMA5-RDPE；

(3)以步驟(2)獲得的質粒pMA5-RDPE為模板，用引物對pMA5-RDPE-F3/pMA5-RDPE-R3擴增線性化的載體pMA5-RDPE3，將PCR產物進行膠回收后以T4多聚核苷酸激酶進行處理，然后加入T4連接酶以使載體自連；將連接體系轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，獲得重組質粒pMA5-RDPEL，其中pMA5-RDPE-F3序列為GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC，pMA5-RDPE-R3序列為GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTCAAATACATGTTTTACAAAG；

(4)擴增目標蛋白基因，通過膠回收獲得相應的基因片段，所述目標蛋白為枯草芽孢桿菌來源的GroES、DnaK、Pel、PhoA或YwbN，或大腸桿菌來源的PhoA或地衣芽孢桿菌來源的AmyL或真核生物來源的GFP或RFP中的一種；

(5)以步驟(3)獲得的質粒pMA5-RDPEL為模板，使用引物對pMA5-RDPEL-F/R進行PCR，通過膠回收獲得線性化的載體pMA5-RDPEL，其中pMA5-RDPEL-F序列為GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC，pMA5-RDPEL-R序列為GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTC；

(6)將步驟(4)獲得的目標蛋白基因片段與步驟(5)獲得的線性化的載體pMA5-RDPEL進行POE-PCR，得到融合產物；

(7)將步驟(6)獲得的融合產物直接轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，得到對應的重組表達質粒pMA5-RDPE-TP，其中TP代表目標蛋白，該質粒包含組成型強啟動子P_HpaII，氨芐青霉素和卡那霉素抗性選擇標記基因，及由RDPE的編碼序列、21bp的柔性Linker序列和目標蛋白的編碼序列融合而獲得的DNA序列，其中21bp的柔性Linker序列為5’-GGTAGCGGTGGAGGTGGCAGC-3’；

(8)將步驟(7)獲得的重組表達質粒轉化入枯草芽孢桿菌中對目標蛋白進行發酵，實現目標蛋白的分泌表達，發酵培養基為2.0％～4.0％蛋白胨、3.0％～7.0％酵母提取物和0.3％～0.9％磷酸氫二鉀，pH 7.2；活化所構建重組枯草芽孢桿菌菌株，于37℃、200rpm條件下進行搖瓶發酵。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述RDPE是通過非經典分泌途徑分泌到胞外，其并非枯草芽孢桿菌中Sec分泌途徑和Tat分泌途徑等已知經典途徑，也不是因為細胞自溶和裂解而導致的胞內蛋白泄漏現象，而是一種未知的全新的蛋白分泌途徑。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RDPE作為分泌信號引導目標蛋白實現了在枯草芽孢桿菌中的分泌表達。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(8)中所述枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌168、WB600、WB700、WB800、1A751、DB104中的一種。