[發(fā)明專利]穩(wěn)定分泌近紅外熒光標記外泌體的乳腺癌細胞株的制備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610055822.9
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105624192B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張宗德;張春;藍文俊;劉曉玫;潘麗萍
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

1.一種穩(wěn)定分泌近紅外熒光標記外泌體的乳腺癌細胞株的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)編碼外泌體標記蛋白CD63基因的獲得：

從人乳腺癌MDA-MB-231細胞中提取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用帶XbaI和ClaI酶切位點，以及Linker序列的引物進行PCR擴增得到目的基因片段CD63-Linker；所述Linker序列為：ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg；

2)重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建：

步驟1)得到的所述CD63-Linker和質(zhì)粒骨架pAAV-iRFP682經(jīng)T4DNA連接酶作用得到重組質(zhì)粒載體pAAV-CD63-Linker-iRFP682；

其中，所述CD63-Linker和質(zhì)粒骨架pAAV-iRFP682的摩爾比例為2～5；

3)重組腺相關(guān)病毒的制備：

使用所述重組質(zhì)粒載體pAAV-CD63-Linker-iRFP682和輔助質(zhì)粒體外共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，包裝重組腺相關(guān)病毒rAAV-CD63-Linker-iRFP682；

所述輔助質(zhì)粒為pDG質(zhì)粒；

4)穩(wěn)定分泌近紅外熒光蛋白標記外泌體的乳腺癌細胞株的制備：

使用所述重組腺相關(guān)病毒rAAV-CD63-Linker-iRFP682和輔助腺相關(guān)病毒共感染人乳腺癌MDA-MB-231細胞，通過熒光篩選獲得穩(wěn)定分泌近紅外熒光蛋白標記外泌體的人乳腺癌MDA-MB-231細胞株；

其中，所述輔助腺相關(guān)病毒為rAAVSVAV2；所述重組腺相關(guān)病毒與所述人乳腺癌MDA-MB-231細胞數(shù)目的比例是3000～6000；

5)近紅外熒光標記人乳腺癌MDA-MB-231細胞的外泌體提取及鑒定：

采用分步離心法從步驟4)標記成功的MDA-MB-231細胞培養(yǎng)上清液中提取iRFP682標記的外泌體并進行鑒定；

所述步驟5)中分步離心法的步驟為：

首先將所述細胞培養(yǎng)上清液在4℃條件下依次經(jīng)2000g離心15min、5000g離心15min及12000g離心30min去除細胞碎片，得第一上清液；

然后將所述第一上清液使用孔徑不大于0.2μm的膜過濾后，4℃、12000g條件下離心120min，得到外泌體粗沉淀；

最后用PBS溶液重懸所述外泌體粗沉淀，混合均勻后于4℃、12000g條件下離心90min，得到提純外泌體，將所述提純外泌體使用PBS溶液重懸后置于-80℃條件保存?zhèn)溆茫?/p>

所述步驟5)中iRFP682標記的外泌體鑒定的方法為：使用western blot鑒定所述外泌體的膜表面蛋白，通過透射電鏡觀察所述外泌體的結(jié)構(gòu)，以及通過SIM結(jié)構(gòu)光照明超分辨熒光顯微鏡觀察外泌體的熒光標記。