[發(fā)明專利]參與甘草酸生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610055678.9
• 申請(qǐng)日: 2016-01-28
• 公開（公告）號(hào): CN107012154A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐國(guó)杰;劉春生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 劉春生
• 主分類號(hào): C12N15/54
• 分類號(hào): C12N15/54;C12N9/10;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12P33/00;C12N15/82;A01H5/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及甘草酸生物合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)基因，并利用體外酶促反應(yīng)的方法對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行功能活性分析，涉及到甘草酸生物合成途徑中UGT基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甘草酸是一種來源于甘草屬(Glycyrrhiz)植物的三萜皂苷類天然產(chǎn)物，其具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗過敏以及抗病毒等。目前甘草酸已被開發(fā)成注射液在臨床上用于慢性乙肝和急性肝損傷的治療。據(jù)報(bào)道，以甘草酸為主要成分制成的天晴甘美注射劑年銷量可達(dá)16億人民幣。同時(shí)，由于甘草酸的甜度是蔗糖的150倍，它也作為甜味劑遠(yuǎn)銷世界各地，其相關(guān)出口產(chǎn)品年銷量可達(dá)4千萬(wàn)美元，市場(chǎng)需求量大。

植物中甘草酸的生物合成需要其生物合成途徑中的相關(guān)酶進(jìn)行一系列催化反應(yīng)，目前，甘草酸生物合成途徑中的大多數(shù)酶的基因已被成功克隆，并能利用生物技術(shù)的方法人工合成甘草次酸，但是，催化甘草酸合成的最后一步反應(yīng)的UGT基因仍未能被成功克隆。因此，克隆甘草酸UGT基因?qū)?duì)于調(diào)節(jié)和生產(chǎn)甘草酸具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

(1)本發(fā)明要解決的問題

UGT基因是植物中重要的超家族基因，成員眾多，功能多樣，克隆和表征其功能往往十分困難。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請(qǐng)中涉及甘草酸UGT核苷酸及其氨基酸序列。本發(fā)明的目的在于提供甘草酸UGT核苷酸及其氨基酸序列。

(2)技術(shù)方案

為獲得甘草酸UGT核苷酸及其氨基酸序列，我們將克隆得到的甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)中的UGT核苷酸序列連接于表達(dá)載體并在宿主細(xì)胞中表達(dá)獲得蛋白，再經(jīng)過體外催化實(shí)驗(yàn)表征其功能，最終實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。

本發(fā)明具體如下所述。

[1]一種多核苷酸，為以下的(a)、(b)或(c)所示的多核苷酸：

(a)一種核苷酸，其核苷酸序列由SEQ ID No.1所示的第1-1446位核苷酸組成；

(b)一種多核苷酸，其包含與(a)所述核苷酸序列具有35％或更高百分比同一性的核苷酸序列，并且編碼的蛋白質(zhì)具有甘草酸UGT活性；或

(c)一種多核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與(a)反向互補(bǔ)的核苷酸雜交，并且編碼的蛋白質(zhì)具有甘草酸UGT活性。

[2]一種蛋白質(zhì)，為以下的(A)、(B)或(C)所示的蛋白質(zhì)：

(A)一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列由SEQ ID No.2所示的氨基酸組成；

(B)一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列包含與(A)所述的氨基酸序列具有30％或更高百分比同一性的氨基酸序列，并且具有甘草酸UGT活性；或

(C)一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列包含(A)所述的氨基酸序列中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列，并且具有甘草酸UGT活性。

[3]一種重組載體，其由[1]所述的多核苷酸或編碼[2]所述蛋白質(zhì)的多核苷酸與已知載體重組而成。

[4]一種轉(zhuǎn)化體，其通過將根據(jù)[3]所述的重組載體、[1]所述的多核苷酸或編碼[2]中所述蛋白質(zhì)的多核苷酸導(dǎo)入宿主中制備而成。

[5]在[3]所述的已知載體是已知的細(xì)胞系統(tǒng)載體或已知的無細(xì)胞系統(tǒng)載體。

[6]在[4]所述的宿主是屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬(Enterobacter)或酵母菌屬(Saccharomyces)已知的微生物。

[7]一種生產(chǎn)甘草酸的方法，所述方法是通過培養(yǎng)[4]和[6]中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體來直接生產(chǎn)甘草酸。

[8]含有[1]所述的多核苷酸或編碼[2]所述蛋白質(zhì)的多核苷酸在甘草遺傳育種中的應(yīng)用。

(3)有益效果

在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請(qǐng)中涉及甘草酸UGT核苷酸及其氨基酸序列，本發(fā)明提供了甘草酸UGT的多核苷酸序列，它們編碼的蛋白具有甘草酸UGT活性，并可用于調(diào)節(jié)和生產(chǎn)甘草酸。