[發明專利]一種多形微眼藻熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201610055659.6
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105624295B
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發明（設計）人: 甄毓;喬玲;米鐵柱
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12R1/89
• 代理公司: 37104 青島高曉專利事務所(普通合伙)
• 代理人: 張曉波

本發明公開了一種多形微眼藻熒光定量PCR檢測方法，其中，包括A、藻種培養及收集，B、藻類總DNA的提取，C、核糖體18S rDNA的PCR擴增，D、電泳檢測及測序，其特征在于，進一步包括如下步驟：E、多形微眼藻熒光定量PCR特異性引物的設計和驗證，F、多形微眼藻18S rDNA質粒標準品制備，G、多形微眼藻細胞?質粒標準曲線的建立，H、環境樣品中多形微眼藻的定量。本發明利用多形微眼藻的特異性引物通過熒光定量PCR技術對海水中的多形微眼藻進行檢測，在確保準確性的基礎上，不僅提高了靈敏度，而且實現了樣品在短時間內進行大批次處理的目的，大大縮短了工作時間，為實現對多形微眼藻進行快速、準確的定性定量研究提供了強大的工具。

技術領域：

本發明涉及海洋浮游植物檢測的技術領域，特別涉及多形微眼藻熒光定量PCR檢測方法。

背景技術：

浮游生物包括浮游植物和浮游動物兩大類。浮游生物個體小，生活周期短，繁殖速度快，對環境的變化十分敏感，對水體的營養狀態的變化能夠迅速地做出反應。在水質好的水域，浮游生物的多樣性指數及均度指數均較大；反之，浮游生物的種類多樣性下降，分布呈現不均勻的情況。浮游植物，是海水中某些微小的微型藻、原生動物或細菌在一定的環境條件下爆發性增殖或聚集在一起而已發赤潮現象。赤潮發生時會有大量的魚類和貝類死亡，導致重大的經濟損失和嚴重的海洋生態災難，毒素還會富集在貝類和魚類的體內，人類使用后會引發疾病。

為預防赤潮的發生，需要對水體中藻類進行種類和數量檢測，現階段針對藻類的熒光定量PCR檢測方法較多，如中國專利公開號，CN 101906467 A公開了一種熒光定量PCR檢測微小原甲藻的方法，包括：(1) 藻液的預處理抽取海域中的樣品藻液，離心收集細胞，然后用pH 7.0 的PBS 緩沖液洗滌兩次后重懸，制成密度為2.5×108cell/L 的待處理藻液；(2) 熒光定量PCR 引物及濃度優SYBR 法的熒光定量引物序列為：PM-1iF ：CCCCCATGCAGAGACTCAA，PM-1iR ：CAGCAAGGACAGGCACAGAA ；引物終濃度為：200nmol/L ；(3)微小原甲藻的細胞個數和基因組DNA 檢測取步驟(1) 中得到的待處理藻液于離心管中，在冰浴中進行超聲波處理，顯微鏡觀察直至所有細胞均被破碎，將藻液按1：10 倍稀釋，5 個稀釋度，每個稀釋度重復3 次，然后進行熒光定量PCR 擴增，計算得出微小原甲藻的細胞個數。再如中國專利公開號CN 102392076 A公開了一種產2-MIB 藍藻的PCR 定性和TaqMan熒光定量PCR 定量的檢測方法，其步驟是：A、采集待測水樣，經0.45μm 的醋酸纖維素膜過濾，將過濾到的藻進行總基因組DNA 的提取和純化，將提取到的DNA 溶于無菌雙蒸水中，置-20℃保存；B、定性PCR 的反應體系為：2×PCR 反應體系10μl，特異性擴增2-MIB 合成相關單萜環化酶基因的正反引物各1μl，待檢測的DNA 1μl，以雙蒸水校正至20μl 體積，所用引物為：CITf5-CAGCACGACAGCTTCTACACCT-3，CITr 5-GCCGCAATCTGTAGCACCAT-3，以產2-MIB藍藻DNA 為陽性對照，雙蒸水為陰性對照；C、定性PCR 的反應程序為：94℃預變性3min，接著40 個循環，每個循環94℃ 30s、58℃ 30s 和72℃ 30s，循環過后最后72℃延伸5min ；D、定性PCR 產物和陽性對照、陰性對照一起進行2％ w/w 瓊脂糖凝膠電泳，電泳過后溴化乙錠染色，紫外燈下觀測，目標條帶長度為206bp 。