[發明專利]蝴蝶蘭成花相關GIGANTEA基因（DhGI1）的編碼序列及應用

在審

• 申請號: 201610054886.7
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105543241A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 崔永一;羅小燕;周明兵;張遲;秦巧平
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體是涉及一種在蝴蝶蘭中表達的成花相關GIGANTEA基因(DhGI1)的克隆，該基因序列的分析，基因表達模式的分析，目的基因表達載體的構建，植物轉化，轉基因植株的獲得以及相應的生理特性的鑒定。

背景技術

蝴蝶蘭作為一種具有較好經濟價值和觀賞價值的花卉深受國內外消費者的喜愛，但其成花需要電力降溫或高山催花，這就大大提高了其生產成本。因此，很多學者就嘗試通過基因工程手段調控蝴蝶蘭花期，以降低生產成本。韓穎穎等(2004、2005)在蝴蝶蘭花瓣中得到了查爾酮合酶cDNA(pchs)，并成功轉化煙草證明其參與花的形態建成。Zhang等(2010)在Phalaenopsishybrida(cv.weddingpromenade)中成功分離得到FLORICAULA/LEAFY(FLO/LFY)的同源基因PhalLFY，通過半定量RT-PCR得出PhalLFY是蝴蝶蘭成花的關鍵基因。轉基因方面的研究也取得了一定的進展，Belarmino等(2000)首先成功報道了用農桿菌介導的方法開展蝴蝶蘭轉基因；Mishiba等(2005)用未成熟的圓球莖與農桿菌(包含gus和潮霉素抗性基因)共培養，在篩選培養基上(含20mg/L的潮霉素)PLB再生獲得蝴蝶蘭抗潮霉素的抗性植株；Qin等(2010)用葉片誘導出的愈傷組織與含有抗冷基因LTP的農桿菌共培養，得到了大量的抗冷蝴蝶蘭轉基因植株。但是，有關蝴蝶蘭GIGANTEA基因(DhGI1)的研究還尚未見報道。

目前GI基因及同源基因功能分析主要集中在如擬南芥、金魚草等長日照植物和水稻、菊花等短日照植物上，研究表明GI基因在不同物種中的功能差異很大，有時甚至相反，如在擬南芥GI基因的表達是促進開花，而在水稻則抑制開花。目前GI基因在光期鈍感植物的生物學功能研究尚未見報道，對開花具體調控機理尚不清楚。

本發明研究了一種從蝴蝶蘭中克隆出來的與成花相關GIGANTEA基因(DhGI1)，轉入擬南芥后引起花期提早。而在本發明公布之前尚未見公開報道過蝴蝶蘭成花相關GIGANTEA基因(DhGI1)的核苷酸序列及其在轉基因植株中應用的資料。本申請探明了GI基因在光期鈍感植物的生物學功能，通過對比試驗摸索了一套光周期頓感植物誘導其成花方法。同時，理論上還揭示了蝴蝶蘭成花"溫敏"現象的分子機理。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種從蝴蝶蘭中克隆出來的與成花相關的GIGANTEA基因，以及利用該基因在調控植物花期上的應用。

解決上述技術問題采用如下技術方案：

本蝴蝶蘭成花相關GIGANTEA基因(DhGI1)為具有特定序列的DNA分子，編碼區全長4022bp，包含一個3483bp的開放閱讀框，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

本蝴蝶蘭成花相關GIGANTEA基因(DhGI1)編碼的蛋白質分子，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸編碼序列。

本蝴蝶蘭成花相關GIGANTEA基因(DhGI1)的核苷酸引物序列，保守區設計的一系列的RACE引物和RT-PCR引物序列見表1和表2。

表1.通用引物

表2.RACE特異性引物和RT-PCR引物

本蝴蝶蘭成花相關GIGANTEA基因(DhGI1)的核苷酸編碼序列SEQIDNO.1轉入擬南芥以改變開花時間的方法按如下步驟進行：

(1)將蝴蝶蘭GIGANTEA基因(DhGI1)的開放閱讀框連接入植物表達載體，形成含有蝴蝶蘭DhGI1基因的植物表達載體；

(2)將步驟(1)中的表達載體轉入農桿菌，用含有表達載體的農桿菌菌液浸泡擬南芥花序，收集轉基因種子；

(3)通過對擬南芥種子抗生素篩選和PCR鑒定，獲得再生轉基因植株，開花時間比野生型擬南芥提早。

本發明還提供了一種用于檢測樣品中是否存在蝴蝶蘭DhGI1基因的核苷酸序列SEQIDNO.1的方法，使用SEQIDNO.4的核苷酸序列(見表3)對轉基因擬南芥DNA進行PCR擴增，然后電泳檢測目的片段的有無。

表3.驗證用引物序列