[發明專利]博來霉素衍生物6’-脫羥基-BLM S的高產菌株

有效

• 申請號: 201610054780.7
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105733979B
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 段燕文;沈奔;朱湘成;黃勇;楊虎
• 申請（專利權）人: 長沙天賜生物醫藥科技有限公司;長沙慈航藥物研究所有限公司;哈藥慈航制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N13/00;C12N15/01;C12P21/02;C12R1/465
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 馬強;周棟

本發明通過對產生活性博萊霉素衍生物6’?脫羥基?BLM S(天賜博星)的原始菌種SB9026(保藏號CCTCCM 2011292)進行基于紫外誘變和核糖體工程的菌種進化，最終篩選獲得一株高產菌株G?4F12(保藏號CCTCCM2015738)，其6’?脫羥基?BLM S(天賜博星)的發酵產率與原始產量相比提高了2倍以上。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及通過對產生新型活性博來霉素衍生物6’-脫羥基-BLM S(天賜博星)的原始菌種SB9026(保藏號CCTCCM 2011292)進行基于紫外和核糖體工程誘變的菌種進化，最終篩選獲得6’-脫羥基-BLM S(天賜博星)的高產菌株。

背景技術

博來霉素(Bleomycin，英文簡字BLM)是20世紀60年代從輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的發酵產物中分離發現的一類糖肽類抗腫瘤抗生素。目前已有十余種博來霉素天然組分被發現，它們的結構僅在末端胺基上存在差異，其中主要成分為博來霉素A2(55％～70％)和博來霉素B2(25％～32％)。佐伯霉素(Zorbamycin，英文簡字ZBM)是由黃綠鏈霉菌(Streptomyces flavoviridis)合成的博來霉素族抗生素，其分子結構與博來霉素極為相似，主要差別在于佐伯霉素中的末端胺基支鏈不同，第一個噻唑啉/噻唑的氧化程度不同，多肽骨架中存在β-羥基化-L-纈氨酸和L-高絲氨酸結構部分，糖基部分為2-O-(3-O-氨基甲酰-甘露糖基)-6-脫氧-L-古洛糖(如圖1所示)。相應的，在佐伯霉素生物合成基因簇(zbm)的40個開放閱讀框(ORF)中，僅有22個顯示出與對應博來霉素生物合成基因簇(blm)開放閱讀框的同源性，其它開放閱讀框的不同很可能導致了上述兩種化合物的結構差異。

博來霉素有獨特的分子結構和生物活性，能夠介導激活氧分子，并選擇性地引起單鏈和雙鏈DNA的斷裂從而抑制腫瘤細胞DNA合成和復制。此外，博來霉素還可以選擇性地裂解RNA從而抑制蛋白質的合成。博來霉素的活性機理決定了其不會抑制骨髓造血系統和免疫系統，因此對人體白細胞，機體免疫功能和造血系統等的副作用較為輕微。博來霉素屬于細胞周期非特異性藥物，從上世紀80年代起被開發成為一種重要的有效抗腫瘤藥物，在臨床上廣泛應用。以BLM A2和B2為主要成分的商品藥就被用于治療睪丸癌，同時還廣泛應用于霍奇金淋巴瘤、鱗狀上皮細胞癌、生殖細胞瘤和其他腫瘤的治療。但是博來霉素能增加活性氧分子從而導致細胞的氧化壓力，并誘導肺中的上皮和非上皮細胞的衰老和凋亡最終導致肺纖維化。因此博來霉素導致的劑量依賴性肺纖維化以及一些腫瘤細胞逐漸形成的耐藥性極大地限制了其臨床應用和推廣。獲得新型的高效低毒的博來霉素族衍生物一直都是開發博來霉素類抗腫瘤藥物的重點。

博來霉素復雜的分子結構使得通過傳統的化學全合成方法來獲取其相關衍生物的過程及其繁瑣且效率低下，無法滿足臨床研究的需要和工業化生產的應用，并且合成的博來霉素衍生物也并未展示出更好的活性或更低的毒性。新興的組合生物合成方法通過遺傳操縱次代謝產物生物合成基因來獲取目標天然產物衍生物，是一種非常有應用前景的高新技術。專利授權號201110276318.9，從佐伯霉素的原始高產菌株黃綠鏈霉菌SB9001出發，應用基因重組技術將黃綠鏈霉菌SB9001中的zbmVIII基因完全失活后得到不生產佐伯霉素的黃綠鏈霉菌突變株，然后以該突變株作為異源宿主，將包含完整博來霉素生物合成基因簇(blm基因簇)的人造細菌染色體質粒blm1-6E轉入其中獲得黃綠鏈霉菌重組工程菌SB9026(保藏號CCTCC M 2011292)。從該重組工程菌的發酵培養產物中我們成功得到一種新型博來霉素衍生物6’-脫羥基-BLM S(天賜博星)，并且初步生物活性測試表明6’-脫羥基-BLM S的DNA裂解活性至少是BLM A2的10倍以上。這說明在更少用量的條件下，6’-脫羥基-BLM S比目前臨床使用的任何一種博來霉素類抗癌藥物的毒性都要低，因此作為迄今為止發現的最有效的博來霉素衍生物，6’-脫羥基-BLM S很有希望成為博來霉素族化合物中的新型抗癌藥物。