[發明專利]一株谷氨酸棒桿菌及其過量合成磷脂酰絲氨酸的方法

有效

• 申請號: 201610054776.0
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105602880B
• 公開（公告）日: 2019-03-05
• 發明（設計）人: 劉逸寒;路福平;李瑞
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/12;C12N15/54;C12N15/77;C12P13/06;C12R1/15
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

1.一種高產磷脂酰絲氨酸的谷氨酸棒桿菌工程菌，其特征在于，所述工程菌，是將谷氨酸棒桿菌宿主細胞中表達L-絲氨酸脫氨酶的sdaA基因進行敲除，并串聯表達磷脂酰絲氨酸合成酶的表達基因pssA基因、3-磷酸甘油酸脫氫酶的表達基因serA^Δ197基因和CDP-甘油二酯合成酶的表達基因cdsAM基因；

所述pssA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；

所述serA^Δ197基因來源于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示；

所述cdsAM基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示。

2.如權利要求1所述的一種高產磷脂酰絲氨酸的谷氨酸棒桿菌工程菌，其特征在于，所述磷脂酰絲氨酸合成酶的表達基因為pssAM基因，pssAM基因為pssA基因的突變基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

3.一種CDP-甘油二酯合成酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示。

4.權利要求3所述CDP-甘油二酯合成酶突變體的編碼基因，其特征在于，所述基因為cdsAM基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示。

5.如權利要求1所述一種高產磷脂酰絲氨酸的谷氨酸棒桿菌工程菌，其特征在于，所述工程菌具體為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)M-1，保藏編號為CGMCCNo.11923，該菌的宿主細胞為谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032。

6.如權利要求1所述一種高產磷脂酰絲氨酸的谷氨酸棒桿菌工程菌的構建方法，其特征在于，具體如下：

(1)谷氨酸棒桿菌sdaA缺失菌株的構建；

(2)擴增磷脂酰絲氨酸合成酶的表達基因，連接至pXMJ19，構建重組質粒；

(3)以谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組DNA為模板，擴增serA^Δ197基因片段，并連接至步驟(2)所得重組質粒上，構建出新的重組質粒；

(4)擴增CDP-甘油二酯合成酶的表達基因，并連接至步驟(3)所得重組質粒，構建出新的重組質粒；

(5)將步驟(4)所得重組質粒轉化至谷氨酸棒桿菌sdaA缺失菌株感受態細胞中；獲得了一株過量合成磷脂酰絲氨酸的重組菌株。

7.一種磷脂酰絲氨酸的制備方法，其特征在于，具體如下：

1)菌株：以權利要求1-2所述的工程菌株為生產菌株；

2)培養基

活化斜面或平皿培養基：牛肉膏7～12g/L，酵母粉3～6g/L，蛋白胨7～12g/L，氯化鈉3～6g/L，玉米漿120～160mL/L，瓊脂條10～40，調節pH至7.0～7.2，121℃滅菌15min；

種子或發酵培養基：葡萄糖20～40g/L，玉米漿15～45mL/L，豆粕水解液10～30mL/L，K₂HPO₃·3H₂O 1～3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～2g/L，尿素2～4g/L，調節pH至7.0～7.2，121℃滅菌15min；

3)搖瓶培養

將30℃、150～250rpm下培養10～14小時的種子培養液以2％接種量轉入發酵培養基，于30℃、150～250rpm條件下培養，在培養4～8h時加入IPTG終濃度為1.0mmol/L，繼續培養22～25h。

8.如權利要求7所述的一種磷脂酰絲氨酸的制備方法，其特征在于，所述生產菌株為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)M-1，保藏編號為CGMCC No.11923。