[發明專利]蜂素信號肽介導雞傳染性支氣管炎病毒N蛋白分泌表達的方法

在審

• 申請號: 201610054479.6
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105602990A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 磨美蘭;張志鵬;張麗華;何怡寧;孫新寬;韋平;韋天超
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/62
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種蜂素信號肽介導雞傳染性支氣管炎病毒N蛋白分泌表達的方法，其特征在于先 獲取融合蜂素信號肽的雞傳染性支氣管炎病毒N基因HBM-N，然后構建重組轉移載體pFast- HBM-N和重組桿粒rHBM-N，最后將重組桿粒轉染Sf9昆蟲細胞用于分泌表達雞傳染性支氣管 炎病毒N蛋白。

2.根據權利要求1所述的蜂素信號肽介導雞傳染性支氣管炎病毒N蛋白分泌表達的方 法，其特征在于：所述獲取融合蜂素信號肽的雞傳染性支氣管炎病毒N基因HBM-N采用的N基 因擴增引物和蜂素信號肽的擴增引物分別為：

上游引物N-F5′-CATTTCTTACATCTATGCGGATCGAATGGCAAGCGGTAAAGCAGCT-3′，

下游引物N-R5′-CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGGCCTTGAAAGTACAAGTTTTCAAGTTCA TTCTCTCCAAGTGCTGAATCG-3′；

上游引物HBM-F5′-CCGCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTC-3′，

下游引物HBM-R5′-TCGATCCGCATAGATGTAAGAAATGTATACGACCATAAAAACAAGGGC-3′。

3.根據權利要求1所述的蜂素信號肽介導雞傳染性支氣管炎病毒N蛋白分泌表達的方 法，其特征在于包括以下步驟：

(1)HBM-N的獲取

對感染雞傳染性支氣管炎病毒GX-YL5株的SPF雞胚尿囊液進行總RNA抽提，反轉錄獲得 cDNA，以cDNA為模板，采用上下游引物N-F和N-R進行PCR擴增，獲得雞傳染性支氣管炎病毒N 基因；再利用蜂素信號肽上下游引物HBM-F和HBM-R擴增出完整的蜂素信號肽HBM；然后以蜂 素信號肽和N基因為模板將兩段基因進行融合，獲得融合蜂素信號肽的基因HBM-N；

(2)構建重組轉移載體pFast-HBM-N

將步驟(1)獲得的目的基因HBM-N定向插入pFastBac^TMDual載體中，獲得的陽性質粒即 為重組轉移載體pFast-HBM-N；

(3)構建重組桿粒rHBM-N

將步驟(2)獲得的重組轉移載體pFast-HBM-N轉化DH10Bac^TM感受態細胞，通過Kan、Tet、 Gen三種抗生素，IPTG、X-gal藍白斑篩選，挑取陽性菌多次劃板獲得純化重組桿粒rHBM-N；

(4)重組桿粒rHBM-N轉染Sf9細胞

將重組桿粒rHBM-N利用脂質體介導轉染Sf9細胞，用于分泌表達雞傳染性支氣管炎病 毒N蛋白。