[發(fā)明專利]檢測(cè)雜合性DMD基因缺失的方法及所用引物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610053964.1
• 申請(qǐng)日: 2016-01-26
• 公開（公告）號(hào): CN105441580B
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪旭濤;祁鳴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 紹興華因生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發(fā)明公開了一種檢測(cè)雜合性DMD基因缺失的引物，引物是針對(duì)DMD基因的79個(gè)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)的產(chǎn)物為370?400bp的特異性引物，每對(duì)特異性引物至少有20bp的重疊區(qū)，在特異性引物的5’端，設(shè)計(jì)一段通用序列以及5個(gè)連續(xù)的N堿基；稱為標(biāo)簽。本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述引物進(jìn)行的檢測(cè)雜合性DMD基因缺失的方法。本發(fā)明是基于二代測(cè)序，利用本發(fā)明的方法，可以檢測(cè)純合型、雜合型的缺失，從而可以有效的檢測(cè)DMD遺傳病的攜帶者，從而通過產(chǎn)前診斷、試管嬰兒等方法指導(dǎo)孕婦生育健康的嬰兒。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于二代測(cè)序檢測(cè)基因缺失突變的方法。

背景技術(shù)

DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)肌肉遺傳性疾病，一種X染色體連鎖隱性遺傳病，國(guó)內(nèi)一般稱為杜氏型肌營(yíng)養(yǎng)不良或假肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良。發(fā)病情況比較復(fù)雜，約有65％左右與遺傳有關(guān)，35％為個(gè)體突變所致。DMD是肌營(yíng)養(yǎng)不良中發(fā)病率最高的一型。還有一種良性亞型，叫BMD(Becker Muscular Dystrophy)，稱為貝克型肌肉營(yíng)養(yǎng)不良。由于體內(nèi)能夠保留部分的不完整的抗肌萎縮蛋白，患者通常較晚出現(xiàn)癥狀(5-15歲)，臨床表現(xiàn)較輕，發(fā)展相對(duì)緩慢，病程較DMD更長(zhǎng)，全國(guó)每年新增約3000名DMD/BMD病人，患者總數(shù)約有10萬人。

由于基因定位于Xp21.1-p21.3，為迄今為止發(fā)現(xiàn)的人類最大基因。該基因的缺失、重復(fù)或點(diǎn)突變，造成肌營(yíng)養(yǎng)不良病人無法合成正常的抗肌萎縮蛋白(Dystrophin蛋白)，肌細(xì)胞膜失去完整骨架，造成肌細(xì)胞膜損傷，肌肉細(xì)胞進(jìn)行性破壞。臨床表現(xiàn)主要為骨骼肌進(jìn)行性萎縮，肌力逐漸減退，喪失活動(dòng)能力。由于肌肉細(xì)胞呈進(jìn)行性破壞，若不治療干預(yù)，DMD病人通常在12歲前失去行走能力，最終因心肺功能衰竭在20～30歲死亡。由于體內(nèi)能夠保留部分的不完整的抗肌萎縮蛋白，BMD病人通常較晚出現(xiàn)癥狀(5-15歲)，臨床表現(xiàn)較輕，發(fā)展相對(duì)緩慢，壽命通常在50歲以上。

由于DMD暫無有效的藥物進(jìn)行治療，因此，進(jìn)行孕前篩查然后預(yù)防該缺陷病嬰兒的出生是最有效的的措施。

然而，DMD是人體最大的基因，包含79個(gè)外顯子，DMD病人是由于某個(gè)(或多個(gè))外顯子缺失、重復(fù)或點(diǎn)突變?cè)斐傻摹４_診DMD，首選抽血檢查遺傳基因。這是無創(chuàng)性的并可準(zhǔn)確提供多種信息的檢測(cè)手段。目前的MLPA法可以檢測(cè)缺失和重復(fù)，但存在較大的假陰性情況，而利用二代測(cè)序，可以檢測(cè)點(diǎn)突變以及20bp以內(nèi)的小片段缺失插入，而對(duì)雜合性的大片段缺失和重復(fù)則無能為力。而qPCR法只能驗(yàn)證已知的缺失突變，不能對(duì)未知區(qū)域的缺失進(jìn)行檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用二代測(cè)序技術(shù)(包括檢測(cè)雜合性DMD基因缺失的引物)，對(duì)雜合型的DMD基因大片段缺失進(jìn)行檢測(cè)；從而找到DMD疾病的攜帶者。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

對(duì)DMD基因的79個(gè)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)產(chǎn)物為370-400bp的特異性引物，每對(duì)特異性引物至少有20bp的重疊區(qū)，在特異性引物的5’端，設(shè)計(jì)一段通用序列(uniseq)以及5個(gè)連續(xù)的N堿基，稱為標(biāo)簽，這樣正向和反向各有5個(gè)隨機(jī)的堿基N，總共10個(gè)N；uniseqF通用序列為：CTACACGACGCTCTTCCGATCT；uniseqR通用序列為GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC。所有序列都進(jìn)行鎖核酸修飾，引物在life公司(原英俊公司)合成，結(jié)構(gòu)中β-D-呋喃核糖的2'-O、4'-C位通過縮水作用形成剛性結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)鎖核酸修飾；序列如表1所示：

表1、DMD基因的79個(gè)外顯子的引物序列