[發明專利]用人骨髓間充質干細胞預測遺傳毒性的方法

在審

• 申請號: 201610053920.9
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105567829A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 劉薇;崔曉宇;秦會
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 溫福雪;李寶元

技術領域

本發明涉及一種評價化學品或環境樣品早期遺傳毒性的方法，可用于新藥研發、農藥開發、新型材料研制、化學物質與食品安全性評價、環境監測等涉及人體健康或環境風險評價的領域。

背景技術

在我國新藥、農藥、化學品、食品、化妝品及消毒劑等產品的開發研制過程中，遺傳毒性試驗被正式列入安全性評價的準則或測試規范。遺傳毒性與致癌性密切相關，在致癌性測試篩選中起到重要作用。此外，監測水源、空氣及職業環境中遺傳毒性物質的存在，也需要靈敏、快速、準確的方法。

現階段遺傳毒性檢測的常用體外試驗主要包括細菌回復突變試驗(Ames試驗)、哺乳動物細胞染色體畸變試驗和小鼠淋巴瘤細胞試驗。這些體外檢測方法在遺傳毒性評估方面發揮著重要作用，也是世界各國現階段普遍推薦和接受的檢測方法。但是，這些體外方法有很多局限性：(1)假陽性結果比例較高；(2)細胞都是生長在體外環境的二維空間中并且處于對數生長期，這與復雜的體內三維環境相似度較低；(3)這些方法所采用的檢測體系均為微生物或動物細胞株系，因此所得數據與人體系統相關性較低，使得試驗數據不能進行有效的外推。現有化學品安全性評價常用遺傳毒性體外實驗和動物模型對評價結果尤其是在將結果外推于人類時造成較大的不確定性，可能造成化學品由于假陽性結果而終止繼續研發，或者經大量應用后才暴露其毒性效應，對環境和人類健康造成潛在危害。

針對現有遺傳毒性檢測方法的局限性，將人類干細胞應用于遺傳毒性檢測有望建立一種良好的動物試驗替代方法。人骨髓間充質干細胞作為遺傳毒性檢測平臺，可以避免物種差異導致的體外哺乳動物細胞試驗系統假陽性過高的問題。歐洲替代試驗方法驗證中心(ECVAM)已經驗證了若干種基于鼠胚胎干細胞的發育毒性檢測方法，利用干細胞進行毒性測試是化學品安全性評價的重要發展趨勢。人骨髓間充質干細胞用于遺傳毒性研究與動物實驗、癌細胞系和成體細胞相比具有顯著優勢。人骨髓間充質干細胞是正常的人細胞系，不但可以在體外多代長期培養和大規模擴增，還具有完整的p53基因調控通路，能準確地反應出受到遺傳損傷后細胞的應激效應。通過檢測化學品對DNA損傷通路上關鍵基因的表達變化的影響，對化學品的潛在遺傳毒性安全性評價具有預測性。

DNA損傷反應通路是與遺傳毒性密切相關的通路，DNA損傷應激通過蛋白激酶被激活，導致細胞周期阻滯、DNA損傷修復和細胞凋亡等關鍵事件的發生，DNA損傷導致ATM和ATR基因表達上調，激活DNA損傷蛋白激酶，p53基因被蛋白激酶磷酸化后，p53基因表達上調，激活下游基因p21導致細胞周期阻滯，激活下游基因Gadd45a促進DNA損傷修復，還會調控促凋亡基因Bax表達上調促進細胞凋亡。ATM、ATR基因對DNA損傷應答通路具有激活作用，DNA損傷也會刺激ATM、ATR基因的表達。p53基因不僅是重要的抑癌因子，也對DNA損傷修復、細胞周期調控以及細胞凋亡發揮著關鍵作用。p21基因是p53的下游激活產物，p53和p21的相互調節對于使損傷的細胞發生細胞周期阻滯是必須的。Gadd45a基因也是p53基因下游基因，導致細胞周期G2期阻滯以及DNA損傷修復。γ-H2AX蛋白是DNA雙鏈斷裂的重要標志物，H2AX基因表達變化也與DNA雙鏈斷裂以及相關的DNA修復信號密切相關，H2AX基因受到DNA損傷通路上的蛋白激酶的調控對DNA損傷修復進行應答。因此，人骨髓間充質干細胞DNA損傷反應通路上的所述關鍵基因，作為基因標志物用于早期遺傳毒性檢測，具有靈敏、快速、準確的優勢。

發明內容

本發明根據遺傳毒性測試動物試驗和體外測試方法的不足，提出了一種利用人骨髓間充質干細胞標志基因預測化學品早期遺傳毒性的體外評價方法。

本發明技術方案：

用人骨髓間充質干細胞預測遺傳毒性的方法，步驟如下：

(1)人骨髓間充質干細胞體外培養與增殖，培養至人骨髓間充質干細胞鋪滿培養瓶底部50％以上，沖洗掉培養基，加入胰蛋白酶進行消化，收獲人骨髓間充質干細胞；

(2)人骨髓間充質干細胞接種與體外暴露：調節步驟(1)獲得人骨髓間充質干細胞密度至0.1×10⁶-1×10⁶個/mL，接種于孔板中，培養24h，待人骨髓間充質干細胞適應培養環境，對其進行體外化學品暴露處理；

(3)人骨髓間充質干細胞RNA提取，收獲經步驟(2)處理的細胞，提取總RNA；

(4)采用實時定量PCR進行所述生物標志基因的mRNA表達的檢測。