[發明專利]一種篩選人類EGFR基因多態性的引物組、試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201610053672.8
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105648057B
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: 王琪;呂建新;杜小慧;劉元斌;李恩成;郭哲;趙輝;于若飛;鄺言斌
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學附屬第二醫院
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12N15/11
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 劉慧娟;李馨

本發明屬于生物技術領域，具體組合運用了等位基因特異性擴增、重組酶聚合酶擴增、肽核酸結合DNA和SYBR GreenⅠ顯色四種分子生物學方法。以肺癌EGFR基因多態性為篩選對象，進行基因多態性篩選方法的研究。獲得了一種篩選人類EGFR基因多態性的引物組、試劑盒及其檢測方法；引物序列如SEQ ID NO.1～5?？捎糜趯GFR多態性的篩選和對適合于靶向治療的患者的鑒別。本發明所述方法不需要任何大型設備，或側流篩選試紙的精密試劑、在特異性、敏感性、簡便性和即時篩選等方面都具有很大優勢，預計這種方法將是未來篩選基因多態性、與基因篩查發展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速篩選方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及由等位基因特異性擴增(ASA)、重組酶聚合酶擴增(RPA)、肽核酸(PNA)結合DNA技術以及SYBR GreenⅠ顯色組合而成的一種快速且準確篩選人類EGFR基因多態性(單個核苷酸多態性和基因缺失)的新方法。

背景技術

快速、準確并且簡便的基因多態性篩查方法一直受到廣泛的重視。人類基因組是一個十分穩定的體系，不同的民族、群體和個體都有46條染色體，有相同數目的基因和基因分布，也有基本相同的核苷酸序列。正是基因組結構的這種穩定性保證了人類作為一個物種的共同性和穩定性，也決定了目前基因組測定是有意義的，即有代表性的。

然而人類基因組又是一個變異的體系。在長期進化的過程中，基因組的DNA序列不斷地發生變異。這些變異可能是有害的、有益的或中性的，它們其中的一些被保存下來，導致了不同種族、群體和個體間基因組的差異或多態性。除了同卵雙生子外，沒有兩個個體的基因組是完全相同的。

表皮生長因子受體(EGFR)的基因多態性通常是發生在19號染色體缺失(E746-A750)和21號染色體L858R點突變(最普遍的單個核苷酸多態性)，到目前為止，基于聚合酶鏈反應(PCR)擴增DNA的測序技術已成為一個標準技術，然而，由于該標準技術需要大型的設備和復雜的實驗步驟，包括熱循環設備和DNA測序設備等，目前的分子篩選方法仍然大大阻礙該基因多態性檢測的效果。

目前，等溫酶擴增DNA系統包括基于核酸序列的擴增，環介導等溫擴增(LAMP)，滾環擴增和解旋酶依賴性擴增。最近，智能擴增方法(SMAP)被開發用于篩選EGFR多態性，但其復雜的引物設計，大型設備和對操作人員的專業性高要求是其操作缺點。與此相反，重組酶聚合酶擴增(RPA)是一種較為先進的DNA擴增方法，反應溫度為37℃，引物設計簡便，并具有更快的擴增速度，能得到大量產物。此外，通過ATP水解作用來促進鏈置換擴增使基因擴增方法變得更為有趣和實用。RPA可以適用于擴增不同的DNA和RNA，隨著等溫擴增核酸新技術的逐漸產生，重組酶聚合酶擴增以其極快的擴增速度備受矚目。

重組酶聚合酶擴增(RPA)最突出的特點是利用重組酶與引物寡DNA的結合，尋找到目的序列，在單鏈結合等蛋白作用下低溫(36-40℃)打開雙鏈DNA，具有高特異性、高敏感性，能夠快速產出目的DNA片段。遺憾的是，RPA擴增方法還沒有被用于快速篩選人類基因多態性。并且，在單個核苷酸多態性的篩選中更是需要大型、精密的儀器或者高端科學及人才。目前基因多態性的篩選都還停留在以實時定量PCR為基礎的方法中，而且并不能普及。

發明內容

本發明的目的是克服上述不足問題，提供一種實用可靠的篩選基因多態性的引物組、其試劑盒及其檢測方法，本發明在特異性、敏感性、簡便性和即時篩選等方面都具有很大優勢。本發明是基于等位基因特異性擴增(ASA)，重組酶聚合酶擴增(RPA)，肽核酸(PNA)，和SYBR Green I染料，即AS-RPA-PNA-SYBR(ARPS)系統的基因篩選新方法，目的是識別EGFR基因多態性，這可用于對EGFR多態性的篩選。該系統中的ASA/AS理論，RPA擴增，PNA和SYBRGreen的結合，不需要任何大型設備，或側流篩選試紙等的精密試劑。只需要用本試劑盒中已設計好的引物組和擴增緩沖液，即可進行篩選檢測。預計這種方法將是未來篩選基因多態性，與基因篩查發展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速篩選方法。