[發明專利]棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體、構建方法及其蛋白表達方法

有效

• 申請號: 201610053452.5
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105543267A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 郭予琦;田曾元;張佳夜;席宇;王智慧
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66;C12N9/78
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體，其特征在于，將棘孢木霉的ACC脫氨酶基 因和質粒pPIC9K連接后，轉化畢赤酵母構建而成。

2.根據權利要求1所述的棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體，其特征在于，所述 棘孢木霉為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)KpS，保藏單位：中國典型培養物保藏中心， 保藏地址：中國武漢武漢大學，保藏編號：CCTCCNO:M2015770，保藏日期：2015年12 月23日。

3.一種如權利要求2所述的棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體的構建方法，其特 征在于，包括以下步驟：

(1)根據棘孢木霉菌株T203ACC脫氨酶基因，設計特異性引物ACC，以棘孢木霉KpS 基因組DNA為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物回收純化，并連接T載體，轉化大腸 桿菌感受態細胞，培養篩選單克隆，挑取單克隆擴大培養，得到大腸桿菌菌液，進行質粒抽 提并測序；

(2)根據步驟(1)的測序結果，設計特異性引物T-acdS，以步驟(1)大腸桿菌菌液為 模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物和載體質粒pPIC9K同時雙酶切，兩個酶切產物連接， 連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，培養篩選單克隆，挑取單克隆擴大培養，質粒抽提并酶 切鑒定，酶切鑒定正確的命名為重組質粒pPIC9K-acds；

(3)用Sacl線性化重組質粒pPIC9K-acdS，然后電轉化畢赤酵母感受態細胞即得。

4.根據權利要求3所述的棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體的構建方法，其特征 在于，步驟(1)的特異性引物ACC為：

正向引物ACC-FP：5’-CACCATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’

反向引物ACC-RP：5’-GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGTTCAAC-3’。

5.根據權利要求3所述的棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體的構建方法，其特征 在于，步驟(2)的特異性引物T-acdS為：

正向引物T-acdS-FP：5’-TACGTAATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’

反向引物T-acdS-RP：5’-GCGGCCGCGTCTAAAAGAGAGGAATACGCGT-3’。

6.根據權利要求3所述的棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體的構建方法，其特征 在于，步驟(1)的PCR反應體系為：2×EsTaqMasterMix12.5μl，基因組DNA0.5μl、10μM 正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，補水到25μl；步驟(1)的PCR反應條件為：94℃預 變性4min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，38個循環；72℃延伸8min。

7.根據權利要求3所述的棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體的構建方法，其特征 在于，步驟(2)的PCR反應體系為：2×EsTaqMasterMix12.5μl，大腸桿菌菌液1μl、10μM 正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，補水到25μl；步驟(2)的PCR反應條件為：94℃預 變性8min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，38個循環；72℃延伸8min。

8.根據權利要求3-7任一項所述的棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體的構建方法， 其特征在于，步驟(2)的雙酶切體系為：10×QuickCutBuffer5μl、載體質粒pPIC9K或PCR 產物1μg，5U/μl的SnaBⅠ和NotⅠ各1μl，補水到50μl；雙酶切條件為：37℃金屬浴消化 1h。

9.一種如權利要求1所述的棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體的蛋白表達方法， 其特征在于，具體步驟為：將棘孢木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體接種到BMGY液體培 養基中，振蕩培養至OD₆₀₀為2-6，離心，棄上清，加BMMY液體培養基重懸，并加入100％ 甲醇誘導表達即得。