[發明專利]突變灰蓋鬼傘過氧化物酶、制備方法和應用

有效

• 申請號: 201610053307.7
• 申請日: 2016-01-25
• 公開（公告）號: CN105441400B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 董冰雪;張磊;方金濤;張偉;石建州;李玉英;夏敏
• 申請（專利權）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N1/21;C02F3/34;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

本發明公開了一種突變灰蓋鬼傘過氧化物酶、制備方法和應用，屬于基因工程及環境技術領域。本發明利用基因合成定點突變平臺合成CIPmt4，經3輪易錯PCR，抗性篩選得到含5個氨基酸突變(I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F)的灰蓋鬼傘過氧化物酶CIPmt5，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。該突變酶的最適反應溫度由野生型的25℃提高到45℃，最適反應pH由原來的5.0提高到6.5，高活性反應pH變寬，穩定性增強，更適于工業化應用。除次甲基藍外，突變酶CIPmt5對染料氨基黑、甲基橙、剛果紅、苯胺藍、結晶紫、溴酚藍的降解最適pH均向中性、堿性方向偏移，并且對7種染料的降解能力均顯著高于野生型酶。

技術領域

本發明涉及一種突變灰蓋鬼傘過氧化物酶，同時還涉及該突變灰蓋鬼傘過氧化物酶的制備方法和應用，屬于基因工程及環境技術領域。

背景技術

隨著染織業發展，大量的染料以廢水的形式排放進入周圍環境，嚴重破壞了生態系統，有毒染料廢水處理已成為困擾環境保護工作的難題。染織業中的偶氮染料具有復雜的芳香環結構，對理化因素、熱和光穩定，較難被生物降解。目前使用的染料廢水處理方法主要包括物理、化學和生物的方法。理化方法成本較高，并且不破壞染料結構，只是把染料從一相轉移到另一相，會形成新的污染；生物降解工藝具有將染料降解或者轉化成二氧化碳和無機鹽的潛能，已經逐漸成為有希望替代現有處理工藝的一種方法，其中酶法降解染料已逐漸引起了人們的重視。

過氧化物酶(EC 1.11.1.7)廣泛存在于動物、植物和微生物體內，是一類以鐵卟啉為輔基、過氧化氫為電子受體的氧化還原酶，可氧化多種有機和無機分子，在免疫檢測、生物傳感器、工業廢水處理方面有著廣泛的應用。過氧化物酶家族中研究最多、應用范圍最廣的是植物來源的辣根過氧化物(horseradish peroxidase，HRP)。但是，HRP的生產受到地域和氣候的限制，產量低、周期長，使其在工業上的應用受到限制。由墨汁鬼傘菌分泌的灰蓋鬼傘過氧化物酶(Coprinus cinereus Peroxidase CIP)一經報道就引起了人們的極大關注，該酶最先由Shinmen分離純化得到，由343個氨基酸組成，與Arthromyces ramo susperoxidase(ARP)在本質上相同。盡管CIP與HRP的同源性不超過10％～16％，但酶學特性和底物廣譜性卻十分相似。研究發現，灰蓋鬼傘過氧化物酶可以參與清除廢水中的酚類物質和苯類物質，并用作清潔劑、生物傳感器等，它能在較寬的pH和溫度范圍內有效降解剛果紅、甲基橙等偶氮類染料，在紙漿造紙工業極具應用潛力。同時CIP的生產不受地域和氣候限制，是一種有望替代HRP成為有廣闊應用前景的工業用酶。

灰蓋鬼傘屬于中溫菌，適宜生長在偏酸性環境中，因此產生的CIP在中溫和偏酸性條件下才表現出較高的催化活性，并且CIP對H₂O₂不穩定。但作為工業酶制劑，有關CIP的諸多應用都要求在中性或堿性條件、高溫環境中進行，例如造紙工業中紙漿的生物漂白，洗滌行業的去污過程等。由于天然CIP的酶學性質致其無法滿足工業化應用要求，其產業化應用受到極大限制。