[發明專利]表達特定重組蛋白的功能化細菌磁顆粒及其制備方法

在審

• 申請號: 201610052911.8
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105624081A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 張金菊;王紅光
• 申請（專利權）人: 北京中科圓融生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/03
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松;懷春穎

技術領域

本發明涉及分子生物學領域和納米磁珠材料領域，具體是涉及表達 特定重組蛋白的功能化細菌磁顆粒及其制備方法。

背景技術

細菌磁顆粒是趨磁細菌生產的一種磁性納米顆粒，內核是Fe₃O₄晶 體，外面有一層磷脂生物膜包被，粒徑在30-120nm之間。同一種趨磁細 菌生產的細菌磁顆粒粒徑大小和晶體晶型基本一致，磁學性質均一，有 天然生物膜包被，具有很好的水溶性質和膠體性質。此外，因為細菌磁 顆粒是生物來源，因此具有較好的生物相容性。細菌磁顆粒膜上帶有大 量的氨基基團，可通過化學修飾和雙功能偶聯劑連接不同的功能大分子， 如抗體，從而具有不同的特殊功能。細菌磁顆粒最獨特的地方在于它可 以通過基因工程的方法在細菌磁顆粒膜上表達特殊的蛋白質，功能性的 靶蛋白可以在細菌磁顆粒上展示出來。

重組蛋白A(rProteinA)來源是金黃色葡萄球菌蛋白A (StaphylococcusProteinA，SPA)，SpA是葡球菌胞璧蛋白，具有獨 特的生物學活性，它能夠與哺乳動物免疫球蛋白IgG的Fc段特異結合。 天然的SPA具有5個同源結構域(A-E)能與IgG結合，但結合強度有差 別，其中的B結構域和IgG的結合力較好。重組蛋白G(rProteinG) 來源是鏈球菌蛋白G(StreptococcusProteinG，SPG)，SPG是A、C 和G群鏈球菌的胞璧蛋白，能和人以及多種哺乳動物的IgG以及人血清 白蛋白(HSA)結合。SPG同IgG的親和力強，結合譜廣，SPG分子中的 C結構域負責同IgG的Fc段結合。

現有技術公開了利用偶聯劑或交聯劑分別將酶、抗體連接在細菌磁 顆粒上，構建磁性復合物，用于固定化酶或檢測病原菌等有害物質；這 些方法的構建都是直接將細菌磁顆粒與上述物質偶聯，而CN104278048 公開了一種重組質粒，該質粒通過磁螺旋菌野生型菌株MSR-1的基因組 DNA為模板，通過帶有(GLy₄Ser)₃Linker的引物擴增得到生物素羧基載體 蛋白基因。現有技術公開的linker的氨基酸序列短，細菌磁顆粒膜蛋白 與不同的抗體或蛋白結合后，會產生兩者的空間結構相互影響的技術問 題。

并且重組蛋白A和重組蛋白G最普遍的應用是原核表達后偶聯到凝 膠樹脂或者磁珠上用作免疫分析及純化等用途。但現有技術中普遍存在 著重組蛋白與磁珠或磁性顆粒結合形成的顆粒與IgG的結合特異性差， 負載IgG的載量低等技術問題。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供一種新的表達特定重組蛋白的功 能化細菌磁顆粒，該功能化細菌磁顆粒通過引入一個較長的多肽鏈，從 而克服了兩種不同蛋白的空間結構相互影響的技術問題，并且制備而成 的功能化細菌磁顆粒與IgG的結合特異性強，負載IgG的載量高。

本發明具體技術方案如下：

本發明提供一種表達特定重組蛋白的功能化細菌磁顆粒，該功能化 細菌磁顆粒的結構物質由特定重組蛋白通過多肽鏈與細菌磁顆粒膜蛋白 融合表達而成；所述多肽鏈的氨基酸殘基為 (Ala_mGlySer)_n(Gly_aSer)_b(GlySerAla_m)_n，m＝2-5，n＝2-5，a＝2-5，b＝3-7。

進一步的改進，所述細菌磁顆粒膜蛋白基因為mamC或mamF。

本發明提供的功能化細菌磁顆粒是由重組趨磁細菌合成，該重組趨 磁細菌是通過如下方法構建而成的：

a)構建細菌磁顆粒膜蛋白基因缺失的趨磁細菌MSR-1突變株；

b)構建功能化細菌磁顆粒膜蛋白融合表達質粒；

c)將功能化細菌磁顆粒融合表達質粒通過接合轉入到步驟a制得的 趨磁細菌MSR-1突變株，構建重組趨磁細菌MSR-1。

進一步的改進，述多肽鏈的氨基酸殘基為 (Ala_mGlySer)_n(Gly_aSer)_b(GlySerAla_m)_n，m＝3，n＝3，a＝2-5，b＝3-7。