[發明專利]一株高效分泌D-阿洛酮糖 3-差向異構酶的基因工程菌株、構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201610051547.3
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105602879B
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發明（設計）人: 張大偉;陳景奇;付剛;朱玥明;孫媛霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/61;C12N15/75;C12N9/90;C12R1/125
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1.一種高效分泌表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌株1A751SD-XR，該菌株通過在出發菌株1A751-amyE::P_araR-spe中敲除染色體上的xylAB操縱子，并轉入pMA5-P_xylA-RDPE質粒獲得，其具體步驟為：

(1)PCR擴增或化學合成rdpe基因序列，rdpe基因為瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因，其序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)將rdpe基因插入表達質粒pMA5，構建重組表達質粒pMA5-RDPE；

(3)以誘導型啟動子P_xylA替換pMA5-RDPE上的組成型啟動子P_HpaII，構建重組表達質粒pMA5-P_xylA-RDPE；

(4)在amyE被P_araR-spe替換的枯草芽孢桿菌1A751，即1A751S的染色體上進一步敲除xylAB操縱子基因，得到宿主枯草芽孢桿菌1A751SD；

(5)在1A751SD中導入重組表達質粒pMA5-P_xylA-RDPE，從而獲得基因工程菌株1A751SD-XR。

2.根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌基因工程菌株1A751SD-XR，其特征在于：1A751SD-XR菌株為xylAB操縱子基因缺陷型菌株，其所含質粒上含有木糖誘導啟動子P_xylA。

3.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌基因工程菌株1A751SD-XR在分泌生產D-阿洛酮糖3-差向異構酶中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，主要包括以下步驟：將基因工程菌株1A751SD-XR用種子培養基活化后，將種子液以0.5％～5％接種量轉入裝液量50％～70％的發酵罐中，通氣量1.0～2.0vvm，攪拌轉速100～800rpm，pH不作控制，于37℃培養；待發酵液OD₆₀₀穩定后以恒定流速進行補料；發酵培養基成分為2.0％～4.0％蛋白胨、3.0％～7.0％酵母提取物、0.3％～0.9％磷酸氫二鉀和1.0％～3.0％可溶性淀粉，初始pH7.2；補料培養基為2.0％～8.0％可溶性淀粉；當基因工程菌株需誘導表達時，待發酵液OD₆₀₀達到0.8時添加一定濃度的誘導物木糖。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，將基因工程菌株1A751SD-XR用種子培養基活化后，將種子液以1.0％接種量轉入裝液量60％的發酵罐中，通氣量2.0vvm，攪拌轉速200～600rpm，pH控制在7.2，于37℃培養；發酵培養基成分為3.0％蛋白胨、5.0％酵母提取物、0.6％磷酸氫二鉀和2.0％可溶性淀粉，初始pH7.2；補料培養基為8.0％可溶性淀粉；當基因工程菌株需誘導表達時，待發酵液OD₆₀₀達到0.8時添加一定濃度的誘導物木糖。