[發(fā)明專利]用于檢測黃曲霉毒素M1的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610051362.2
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105566494B
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁宗輝;陶燕飛;彭大鵬;楊碧嘉;王玉蓮;潘源虎;陳冬梅
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K16/14
• 分類號: C07K16/14;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發(fā)明公開了一種能特異性識別黃曲霉毒素M1的單克隆抗體,它是由雜交瘤細胞株AFM1/3D8所分泌的，所述的雜交瘤細胞株AFM1/3D8，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:C201559。本發(fā)明還公開了檢測黃曲霉毒素M1的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體只識別黃曲霉毒素M1，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫方法和試劑盒具有檢測靈敏度、準確度高，精密度好，簡便、快速等優(yōu)點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸藥殘留分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能識別黃曲霉毒素M1的單克隆抗體和一種用于檢測黃曲霉毒素M1的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)。

背景技術(shù)

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌的次級代謝產(chǎn)物。其是一類結(jié)構(gòu)相似的化合物，都含有二呋喃環(huán)和香豆素。其有20多種，目前分離鑒定的有12種，常見的主要為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2。黃曲霉毒素M1主要污染牛奶及其奶制品，黃曲霉毒素M1的毒性極強，且具有致癌性。隨著人們生活水平的提高，人們對奶制品的需求量越來越大，因此加強對牛奶中黃曲霉毒素M1的殘留監(jiān)控十分必要。

目前檢測黃曲霉毒素M1的方法主要為儀器方法和免疫學(xué)方法。儀器方法雖然靈敏、準確、分離度高并且可進行多殘留檢測的定性、定量研究，但是需要昂貴的儀器、繁瑣的前處理、熟練的專業(yè)操作員。如果采用儀器分析法進行大批量樣品的檢測，其成本將非常高；而且在目前的國家檢測機構(gòu)中大部分只有省市級才配備有精密的分析儀器，因此需要建立一個從篩選到確證的檢測體系。儀器方法顯然不適用于樣品的大量篩選。免疫化學(xué)分析法特別是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)具有快速、靈敏度高、操作簡單、適應(yīng)性強等優(yōu)點，適合高通量樣品篩選，因此對于快速檢測黃曲霉毒素的殘留，ELISA方法更具優(yōu)勢。而制備較高靈敏度的抗體是ELISA方法的根本，只有制備出較高靈敏度的抗體，才能制備出具有競爭性的ELISA試劑盒。江濤等(2007)制備了抗AFM1的單克隆抗體并建立了ELISA方法，標準曲線的線性范圍為0.02～2ng/mL，該方法的檢出限為0.07ng/mL；張園園等(2008)以AFM1-BSA為免疫原，制備了抗AFM1抗體，該抗體的檢出限為0.08ng/mL，線性范圍為0.08～5ng/mL。因此現(xiàn)有抗體的檢測靈敏度不夠高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的為：

(1)提供一種能特異性識別黃曲霉毒素M1的單克隆抗體；

(2)提供所述單克隆抗體在制備黃曲霉毒素M1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中的應(yīng)用；

(3)提供一種能檢測黃曲霉毒素M1的酶聯(lián)免疫試劑盒；

(4)利用該單克隆抗體，建立一種能檢測黃曲霉毒素M1的ELISA方法；

上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種能特異性識別黃曲霉毒素M1的單克隆抗體，它是雜交瘤細胞株AFM1/3D8所分泌的。

所述的雜交瘤細胞株AFM1/3D8，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO:C201559。

所述的單克隆抗體是以黃曲霉毒素M1(AFM1)與羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO)反應(yīng)生成黃曲霉毒素M1肟(AFM1O)，將AFM1O與載體蛋白偶聯(lián)，得到的偶聯(lián)物作為免疫原制備得到的。本發(fā)明中優(yōu)選的免疫原載體蛋白是血藍蛋白(KLH)。

所述的單克隆抗體用于建立相應(yīng)的ELISA方法。

所述的單克隆抗體可以用于制備檢測黃曲霉毒素M1的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

一種檢測牛奶中黃曲霉毒素M1殘留的ELISA方法，包括免疫原、包被原和抗體的制備，間接競爭ELISA方法的建立，其步驟如下：

(1)將AFM1與CMO在堿性條件下反應(yīng)得到的半抗原AFM1O；